固相萃取高效液相色谱法测定康复新液中有效成分KFX-4

王光强，陈鉴东，徐小军，胡礼勇

（浙江京新药业股份有限公司 ，浙江 新昌 312500）

康复新液的主要成分为美洲大蠊（蟑螂）的提取物。功能主治为通利血脉，养阴生肌[1]。康复新液所含成分复杂，真正的活性物质基础不够明确。有关美洲大蠊中药效活性成分的报导较少。随着科技的进步和研究手段的不断完善，为了深入了解康复新液中主要药理作用的物质基础，以及从分子水平基础上阐明康复新液的药效活性成分。我们对美洲大蠊乙醇提取物进行了深入的化学成分研究，并通过活性跟踪筛选，成功地分离到了一种具有显著的抗炎、促进肉芽组织增生、创伤愈合等活性作用的化合物单体成分（简称 KFX-4）[2]，经确证，其化学名为（3R）-3-甲基-7-羟甲基-8-羟基-3，4-二氢异香豆素-6-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构式为：

该化合物的检测方法未见文献报道。为了了解康复新液中KFX-4的含量水平，我们对康复新液中KFX-4的测定方法进行了详细的研究，并建立了检测方法。

1 仪器与试药

Agilent 1200series高效液相色谱仪（DAD检测器）；色谱柱（Waters Symmetry C18柱4.6mm×150mm，5μm），Waters公司；固相萃取小柱：Strata-X（60mg／3mL，Phenomenex公司）；康复新液由内蒙古京新药业有限公司提供；KFX-4对照品：含量：97.7%，浙江京新药业股份有限公司提供。

2 色谱条件

用甲醇－水（20∶80）为流动相，流速：0.8mL·min－1，色谱柱：Waters symmetry C18柱 （4.6mm×150mm，5μm），柱温：30℃，检测波长：265nm，进样量：5μL。按外标法计算。在选定的色谱条件下，测得的色谱见图1。由图1可见，KFX-4峰形良好，且与相邻杂质峰分离完全。KFX-4峰的DAD全波长紫外扫描，见图2，显示最大吸收波长220nm与265nm，由于220nm接近末端吸收，故可选择265nm为检测波长。

3 对照品溶液配制

精密称定KFX-4对照品，用40%甲醇溶解并稀释制成约20μg·mL－1溶液，即得。

图1 康复新液中KFX-4的HPLC

图2 KFX-4紫外吸收图谱

4 康复新液的预处理

精密移取康复新液10mL，10000rpm，离心10min，取离心清液过反相固相萃取小柱（固相萃取小柱使用前依次用1mL甲醇、1mL水活化），用水2mL洗脱两次，去除杂质，再用40%甲醇1mL洗脱并收集洗脱液作为供试品溶液。

5 结果

5.1 标准曲线

配制KFX-4对照品溶液贮备液，并分别稀释制成0.618、1.844、3.688、9.220、18.44、27.66、46.10与92.20μg·mL－1，取上述浓度的溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，得 KFX-4峰面积分别为7.7、20.5、42.38、106.04、211.66、311.01、528.60与1060.15。以 KFX-4对照品的峰面积（A）和KFX-4浓度（X））为X轴进行线性回归，得线性方程为A＝11.498X－0.883，相关系数r＝0.99998。表明在0.618～92.2μg·mL－1范围内，线性关系良好。

5.2 定量限

逐步稀释KFX-4对照品溶液并注入液相色谱仪，记录色谱图，当信噪比约等于10∶1时，此时浓度为0.618μg·mL－1。

5.3 仪器精密度

取浓度21.74μg·mL－1的 KFX-4对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，计算RSD为0.3%。

5.4 准确度

采用加样回收率试验：精密移取090807批康复新液离心清液5mL，分别加入加样对照品溶液（19.6μg·mL－1）0.4、0.5、0.6mL，每个浓度3份，共9份，按测定法制成样品溶液进样分析，记录峰面积并计算回收率。

表1 康复新液中KFX-4含量回收率检测结果（n＝3）

结果表明，该法回收率良好。

5.5 重复性试验

取090807批康复新液，按测定法测定6次，结果分别为2.03、2.19、2.14、2.06、2.12与 2.07μg·mL－1，平均值2.10 μg·mL－1，RSD为2.7%。

5.6 溶液稳定性试验

取康复新液制成的供试品溶液，分别在0、2.5、7.5、13.5、26、38、136h进样测定，记录峰面积。7次的 RSD为1.1%。

5.7 方法的耐用性

5.7.1 流速影响

在色谱条件中，改变流速为0.7mL·min－1与0.9mL·min－1，其它条件不变，按规定方法检测供试品溶液，并与正常检测0.8mL·min－1的数据进行对比。三组数据的总RSD为1.7%。

5.7.2 柱温影响

在色谱条件中，改变柱温为25℃与35℃，其它条件不变，按方法检测样品溶液，并与正常检测30℃的数据进行对比。三组数据的总RSD为1.9%。

5.7.3 流动相比例调整

在色谱条件中，改变流动相比例为甲醇∶水＝18∶82或22∶78，其它条件不变，按方法检测样品溶液，并与正常检测（甲醇∶水＝20∶80）的数据进行对比。三组数据的总RSD为1.9%。

5.8 取康复新液样品

批号为091101、091103与091201的样品按规定方法进行含量测定，结果 KFX-4含量分别为：1.44、1.37和1.35μg·mL－1。

6 讨论

曾尝试直接离心后的上清液进样，结果峰面积非常小且杂质干扰很大。尝试用传统液－液萃取法将KFX-4从康复新液中提取出来，用正丁醇与氯仿均未能获得满意效果，而使用固相萃取技术大大提高了萃取回收率（大于90%），且样品的净化效果极佳，洗脱后的样品液直接进样，康复新液中杂质对KFX-4无干扰。曾选用D101大孔树脂柱，结果发现杂质较多，且基线易漂移。比较而言，Strata-X固相小柱的实验结果最为满意。通过对KFX-4含量测定方法的验证，确定了专属性、重复性、中间精密度、准确度和线性与范围等符合规定，根据数批样品检测结果，本方法可以用于康复新液中KFX-4的控制。

[1]徐小军.一种二氢异香豆素葡萄糖苷化合物及其制备[J].中国药物学，2009，12（7）：23.