熊果酸自微乳给药系统的制备及质量评价

钦富华，林杭娟，高建青

（1.浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100；2.浙江大学药学院，浙江 杭州 310058）

熊果酸又名乌索酸，是广泛存在于植物中的五环三萜类化合物。研究表明熊果酸具有抗肝炎、抗菌、抗肿瘤、抗溃疡、降低血糖等广泛的生物学效应，且毒性低，不良反应小，具有广泛的开发前景［1-2］。熊果酸在水中的溶解度极小，溶出速度很慢，生物利用度低。已有文献报道将熊果酸制成固体分散体、包合物、滴丸及纳米粒等［3-6］，以期提高其溶出及口服生物利用度。

自微乳化给药体系 (self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS)是由油相、表面活性剂及助表面活性剂组成的均一、透明的溶液，一旦与水相混合，在环境温度(通常指体温37℃)下只需要温和搅拌就能自发形成透明或者半透明的微乳。微乳可增加药物的溶解度和吸收面积，处方中含有表面活性剂，可提高药物的溶出，增加小肠上皮的渗透性，有助于提高药物的生物利用度［7-8］。自微乳化给药体系制备简单，性质稳定，将溶液分装于软胶囊中，剂量准确且服用方便，是提高难溶性药物口服吸收的良好载体。本研究制备了熊果酸自微乳制剂，并对其体外性质进行了考察。

1 材料与仪器

1.1 材料 熊果酸对照品 (上海源叶生物科技有限公司，批号YY20100425)；熊果酸原料药 (西安飞达生物技术有限公司，纯度＞98%)；Labrafil M 1944CS、Labrasol、Transcutol P(法国佳法赛公司)；Cremophor EL(德国巴斯夫公司)；甲醇、乙腈为色谱纯，其他药品、试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器 Dionex Ultimate 3000高效液相色谱仪 (美国戴安公司)；Nanosize-90粒径测定仪 (马尔文仪器有限公司)；TU-1810SPC型紫外分光光度计 (北京普析通用仪器有限公司)；SHA-B型数显水浴恒温振荡器 (上海金鹏分析仪器有限公司)；SB25-120超声波清洗机 (宁波新芝生物科技股份有限公司)；METTLER TOLEDO电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；高速离心机 (上海安亭科学仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 熊果酸HPLC方法的建立［9］色谱条件 Agilent TCC18色谱柱 (250 mm×4.6 mm，5μm)；流动相为乙腈-0.3%磷酸 (85∶15)；体积流量为1.0 mL/min；检测波长为210 nm；柱温为30℃；进样量为20 μL。在上述色谱条件下，熊果酸色谱峰理论塔板数大于3000，辅料不干扰熊果酸的测定。熊果酸质量浓度在2.5～120 mg/L的范围内与峰面积呈良好的线性关系，A=0.0852ρ+0.0033，r=0.9999，高、中、低质量浓度的平均回收率为101.3%、101.7%和101.9%，RSD为0.15%、1.11%和1.59%。日内和日间精密度 (RSD)均小于2.0%，符合含量测定要求。

2.2 熊果酸自微乳的处方筛选

2.2.1 熊果酸在油相、乳化剂和助乳化剂中溶解度考察

本研究选择了植物油、油酸乙酯等不同的油相，吐温、Cremophor EL等HLB值较高的乳化剂及乙醇、PEG400等助乳化剂，进行了熊果酸的溶解度考察。各取约2 g的油相、乳化剂及助乳化剂，加入过量的熊果酸，涡旋分散均匀，25℃水浴平衡48 h，10000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm的微孔滤膜过滤，续滤液用甲醇稀释适宜倍数后用HPLC测定。平衡溶解度结果显示熊果酸在油相中溶解不理想，在油酸乙酯和Labrafil M 1944 CS中相对较好，分别为 (1.41±0.07)mg/g和 (2.35±0.26)mg/g；在乳化剂和助乳化剂中，特别是Cremophor EL和Transcutol P中溶解较好，分别为 (10.80±1.58)mg/g和 (10.76±1.21)mg/g。

2.2.2 油和乳化剂的配伍 将油相与乳化剂按2∶3(w/w)的比例在37℃的水浴中振荡混合后观察其分散情况，再加入100倍量的蒸馏水，轻微振荡，观察其乳化情况。根据文献将自微乳化情况分为5个级别:(A)溶液呈澄清或微泛蓝色；(B)略浊，呈蓝白色；(C)呈亮白色不透明液体；(D)色泽暗，呈灰白色，略带油状；(E)难乳化，一直有油滴存在。结果见表1。配伍实验表明以Cremophor EL为乳化剂的乳化效果最为理想，外观呈现透明带蓝色乳光，因此确定乳化剂为Cremophor EL。以辛癸酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯和油酸乙酯为油相的效果相差不大，但结合考虑药物的溶解能力，最终确定油酸乙酯为油相。

表1 不同油相和乳化剂的的配伍情况

2.2.3 助乳化剂的选择 采用滴定法绘制伪三元相图，固定油相为油酸乙酯、表面活性剂为Cremophor EL，考察不同助表面活性剂无水乙醇、1，2—丙二醇、PEG400和Transcutol P形成微乳的能力，将表面活性剂和助表面活性剂按质量比 (Km)1∶1混匀，再与油相以9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的比例混匀。37℃水浴磁力搅拌条件下，滴加水相至形成澄清透明溶液，记录微乳形成时各组分的量，Origin软件绘制伪三元相图。以相图中微乳存在区域的大小来筛选助乳化剂，结果见图1。从相图中可知，以PEG400为助乳化剂时所形成的微乳区域最大，但是由于PEG400和Cremophor EL的互不相溶性，自乳化浓缩液不澄明，体系不稳定。以Transcutol P、乙醇和1，2—丙二醇为助乳化剂时效果相似，但Transcutol P略好，同时药物在Transcutol P中的溶解度较大，故选择Transcutol P为助乳化剂。

图1 含不同助乳化剂的相图

2.2.4 处方优化 对EO/Cremophor EL/Transcutol P进一步进行优化，考察不同Km对自微乳化区域的影响，以粒径大小和分布情况、体系载药量大小为评价指标，最终确定体系的组成为油相为油酸乙酯 (15.0%)，表面活性剂为Cremophor EL(40.0%)，助表面活性剂为 Transcutol P(45%)，熊果酸质量分数为10 mg/g。

2.3 微乳形态和粒径分布 取熊果酸SMEDDS，加蒸馏水稀释50倍，待自乳化完全后，取适量滴在铜网上，用2%的磷钨酸 (pH4.47)负染色，晾干后电镜观察 (见图2)，并用粒径测定仪测定微乳的粒径和电位 (见图3)。熊果酸SMEDDS用蒸馏水稀释50倍后形成的微乳在电镜下观察，乳滴呈圆球形，形态良好。粒径分析仪测定微乳的平均粒径为23.18 nm，多分散指数PDI为0.146，粒径分布集中。微乳的zeta电位为－5.35 mv。

图2 熊果酸微乳透射电镜照片 (×29000)

图3 熊果酸微乳粒径分布图

2.4 体外溶出 取自制熊果酸自微乳胶囊 (含熊果酸5 mg)和熊果酸胶囊 (含熊果酸10 mg)，按照《中国药典》2010年版附录溶出度测定法 (转篮法)测定，以0.5%十二烷基硫酸钠水溶液500 mL为溶出介质，转速100 r/min，温度37℃。依法操作，分别于5、10、20、30、45、60 min取样5 mL，立即补充5 mL介质。样品经0.45 μm滤膜滤过后，取续滤液，加甲醇稀释后HPLC法测定，外标法计算溶出介质中熊果酸含有量，计算累积溶出百分数，结果见图4。体外溶出结果表明，熊果酸SMEDDS在10 min内溶出达80%以上，而胶囊60 min溶出仅20%左右。SMEDDS可大大提高熊果酸的体外溶出。

图4 熊果酸SMEDDS与熊果酸胶囊的体外溶出比较

3 讨论

3.1 溶解度测定的过程中，表面活性剂、助表面活性剂和多数油相均能溶于甲醇，但是植物油、色拉油、橄榄油等不能完全溶于甲醇，故本实验采用了甲醇提取的方法，将少量植物油与甲醇涡旋混合、离心取上清液后测定。

3.2 根据Pouton［10］提出的脂质制剂的分类方法，可以将自微乳化制剂归纳为两类，一类是油相比例较高且不含助乳化剂，一类是油相比例较低并含有助乳化剂。由于熊果酸在油相中的溶解度不是很理想，而在助乳化剂中溶解度较好，因此本研究选择含助乳化剂的体系。助乳化剂的作用一方面协助降低油水界面张力促使微乳易于形成；另一方面也是很重要的助溶剂，能提高微乳的载药量。

3.3 在处方优化的过程中，本研究考察了Km对微乳区域形成的影响，Km增加，微乳形成的区域变大，但是相应的体系的黏度也增大，自微乳化的时间延长。Km值减小，乳滴的粒径变大，且会出现药物析出的现象，可能是助乳化剂中药物被大量稀释后出现“搁浅”现象。

3.4 中药中提取得到的大多数活性成分水溶性均较差，其体外溶出和口服生物利用度较低。自微乳制剂能明显地提高药物的溶出并增加吸收，是难溶性中药的有效载体。自微乳制剂已被证明能增加熊果酸的体内吸收。欧晓霞等［11］以油酸为油相、吐温20和乳化剂OP为乳化剂、异丙醇为助乳化剂制备了熊果酸的自微乳制剂，并以缓释片和混悬液为对照，进行了大鼠体内生物利用度的研究，结果表明自微乳制剂的相对生物利用度为326.5%。本制剂的体内吸收情况有待于研究。

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