定心藤总黄酮的提取及抗氧化活性的研究

黄 琼，田玉红，蒲 香

（广西工学院生物与化学工程系，广西 柳州 545006）

定心藤Mappianthus iodoies为茶茱萸科定心藤属Mappianthus植物，木质藤本，核果椭圆形，果肉薄而甜，为广西瑶医常用药材“十八钻”之一［1］，其根或老藤有祛风活络，除湿消肿和消炎的功效，临床可用于毒蛇咬伤及黄疸的治疗［2］，定心藤中主要含有黄酮，有机酸，生物碱，萜类，甾醇，鞣质等多种化学成分，黄酮类物质具有抗肿瘤、护肝、抗炎、抗病毒、调解内分泌系统等功效［3］。有关植物定心藤的研究已有文献报道［1-2，4-5］，但利用微波辅助提取定心藤中的黄酮及其抗氧化活性的研究还未见报道。本研究通过正交实验考察了微波法从定心藤中提取黄酮类化合物影响的主要因素，研究了提取工艺条件，并通过DPPH·法初步探讨了定心藤总黄酮的抗氧化活性，旨在为定心藤进一步研究和资源开发利用提供一定的科学依据。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器 定心藤 (购于广西柳州药材市场)，粉碎后过十目筛得定心藤细粉；芦丁对照品购于上海市友思生物技术公司；1，1-二苯基苦基苯肼 (1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)购于日本东京化成工业株式会社；乙醇；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠；以上化学试剂均为分析纯；紫外分光光度计 (UV2000型)，上海分析仪器总厂；微波炉(WG800SL23-K6)，广东格兰仕集团有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 定心藤总黄酮供试液的制备 称取一定量的定心藤粉末，加入一定量的乙醇溶液微波辅助提取一定时间，得总黄酮提取液，待测。每个实验在相同条件下提取3个平行样。

1.2.2 总黄酮测定方法［6］吸取一定量的黄酮提取液于50 mL比色管中，加入1.0 mL 5%的NaNO2溶液，摇匀、放置6 min后，加入1.0 mL 10%的Al(NO3)3溶液，摇匀、放置6 min后，加入10 mL 10%的NaOH溶液，加蒸馏水定容至25 mL。放置15 min后，以试剂为空白，于510 nm处测定吸光度A值。从工作曲线方程中计算出总黄酮含有量。

1.2.3 标准曲线的制备 按前述方法，测定不同质量浓度的芦丁溶液的吸光度，得到芦丁溶液质量浓度 (mg/mL)与吸光度值关系曲线。

1.2.4 定心藤中总黄酮提取的工艺设计 选择提取时间、含乙醇量、提取温度、固液比4个因素为考察因素，选用L9(34)正交表对样品中总黄酮提取工艺进行试验。

1.2.5 对羟自由基清除率的测定方法［7-9］将最佳工艺条件下提取的定心藤提取液干燥后，以无水乙醇为溶剂，配制成一定浓度的溶液。准确称量DPPH固体，并将其配制成质量浓度20 mg/mL溶液，避光保存。在10.0 mL的具塞刻度试管中依次加入2 mL DPPH溶液，再加入一定量的不同体积的灵香草提取物溶液，以无水乙醇补加至4.0 mL刻度，充分混合均匀。同时开始计时，在517 nm处测定不同质量浓度的定心藤提取物在各个时间点的吸光度，为能更好的反映变化趋势，实验选择的质量浓度按照双倍稀释法来定。

定义定心藤提取物抗氧化剂对DPPH自由基清除率为［9-10］:

式中:Ai=2 mL DPPH溶液+各个质量浓度定心藤提取物的吸光度 (样品对DPPH·作用后的吸光度数值)；Aj=各个浓度定心藤提取物溶液在体系中未加DPPH溶液时的本底吸光度 (反映样品自身对吸光度的贡献)；Ac=2 mL DPPH溶液+2 mL无水乙醇的吸光度 (为DPPH本身在测定波长的吸收)。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线 由前述方法进行实验操作，质量浓度C与吸光度A作标准曲线回归运算，得回归方程:C=0.0949A+0.001；r=0.9996，线性范围 8.48～43.2 μg/mL。

2.2 定心藤总黄酮提取的正交试验设计 结果见表1。

表1 正交试验设计结果

从表1正交试验数据及计算结果可知，因素对提取率 影响程度从强到弱依次是:固液比、微波作用功率、微波作用时间、含乙醇量。由K值可以判断最佳工艺条件为A2B3C2D3，即微波功率处于中高火、含乙醇量65%、微波作用时间2 min、固液比1∶40。

最佳工艺验证实验:按最优方案提取定心藤总黄酮，得总黄酮提取率为23.017%，优于正交实验及单因素中的任何一组实验，因此可以确认该方案为最优。

2.3 对羟基自由基的清除作用 按照实验方法，将所得的结果吸光度值进行数据处理，求得清除率后作图，图1显示了定心藤提取物对DPPH清除率与时间、浓度的关系，发现定心藤提取物对DPPH的清除率随质量浓度的增大而增大，随时间的增长而增大，50 min后各浓度对其清除率基本稳定不变。

图1 定心藤总黄酮对DPPH的清除能力

根据图1显示结果检测不同质量浓度定心藤提取物60 min时对DPPH的清除率，将所得的结果吸光度值进行数据处理求得清除率后与质量浓度作图得图2。

图2 定心藤总黄酮不同质量浓度对DPPH清除能力的关系

由图2可知，定心藤总黄酮对DPPH自由基清除率在60 min时清除率与质量浓度呈对数关系，线性拟合程度良好。

定义IC50为当清除率达到50%时抗氧化剂样品的浓度，则由拟合对数曲线公式y=9.8845ln(x)+122.33(R=0.9944)，计算得定心藤总黄酮IC50为6.63×10－4mg/mL。对比合成抗氧化剂特丁基对苯二酚 (TBHQ)、丁基羟基茴香醚 (BHA)结果见表2。

表2 定心藤总黄酮与其他合成抗氧化剂比较分析

IC50越小，说明其抗氧化活性越强。由表2可知，抗氧化性能强弱顺序如下:

TBHQ＞定心藤总黄酮＞BHA，定心藤总黄酮具有较强的抗氧化性能。

3 结论

近年来，大量的体内和体外研究表明黄酮类化合物具有较强的抗氧化和清除自由基的活性，同时还具有抑菌、抗衰老、抗心肌缺血、降血脂、降血压等药理保健功能且毒副作用很小，是一类极具开发前景的天然有机抗氧化剂［11］。

本实验通过正交试验确定了微波辅助提取定心藤总黄酮的最佳工艺条件，即微波功率处于中高火、含乙醇量65%、微波作用时间2 min、固液比1:40，在此条件下总黄酮提取率为23.017%，提取率略高于柯永建等［4］用超声波提取的提取率 (17.7%)，而比曾立等［5］用乙醇回流提取高出许多，且用时短，说明微波辅助提取定心藤总黄酮方便、快捷、提取率高，具有明显的优势。

通过考察对DPPH·自由基的清除能力，发现定心藤总黄酮具有较强的抗氧化性能，优于合成抗氧化剂BHA，可为开发一种新型的天然抗氧化剂提供实验依据，也为定心藤进一步研究和资源开发利用提供一定的科学依据。

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