柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏细胞增殖的影响

王 霞， 孙东云， 王香婷， 王 筝， 王聪慧， 许庆友*

（1.河北医科大学中医学院 河北 石家庄 050091；2.河北医科大学中西医结合学院，河北 石家庄 050091）

环孢素A(cyclosporine A，CsA)是目前用于器官移植抗排斥反应以及自身免疫性疾病治疗的一线药物，但其肾毒性所导致的慢性损伤限制了它的长期临床应用。近30%的环孢素A长期使用者会出现显著的肾毒性反应［1］，其病理改变主要表现为肾间质纤维化。已有研究显示肾间质病变与细胞过度增殖有关，故抑制细胞增殖有助于减缓肾纤维化的进展。本实验通过复制慢性环孢素A肾病模型，探讨柴苓汤是否通过调节细胞增殖这一途径减轻环孢素A慢性肾损伤。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 柴苓汤，颗粒型，3g/袋(每1 g制剂相当生药量0.67 g)，购自日本TSMURA株式会社。制备工艺:柴胡7 g、黄芩3 g、半夏5 g、人参3 g、甘草2 g、生姜1 g、大枣3 g、猪苓 3 g、桂枝3 g、白术3 g、茯苓3 g、泽泻5 g，上述药味共煎后提取6 g，加入赋形剂至9 g。实验时用蒸馏水配制成质量浓度为0.3 g/mL的溶液。缬沙坦由北京诺华制药有限公司提供，批号800994。环孢素软胶囊由华北制药集团新药研究发展有限责任公司提供，批号090401，用橄榄油将其配制成质量浓度为15 mg/mL的溶液，备用。免疫组化试剂盒由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。RT-PCR试剂盒由美国Invitrogen公司提供。Western Blot PCNA、FN抗体由美国LABVISION公司提供。流式细胞术PCNA抗体采用武汉博士德生物有限公司产品。

1.2 实验动物及分组 40只雌性清洁级SD大鼠，8周，体质量(200±10)g，河北医科大学动物实验中心提供，许可证号scxk(冀)2008-1-003。随机分为对照组、模型组(环孢素A)、柴苓汤组、缬沙坦组，每组10只。

1.3 造模及药物治疗 实验动物适应性饲养1周后，环孢素A按30 mg/(kg·d)剂量灌服，每日1次，连续28 d，建立慢性环孢素A肾病大鼠模型；对照组每日灌胃给与等容量橄榄油。造模的同时，两治疗组分别给予柴苓汤［3 g/(kg·d)］和缬沙坦［10 mg/(kg·d)］治疗，模型组和对照组每日给予等容量生理盐水，实验第29天，切取大鼠肾脏组织备检。

1.4 指标检测

1.4.1 病理组织学检查 HE、Masson染色，光学显微镜下观察肾脏病理组织学改变，并参照Katafuchi［2］评分标准从间质炎性细胞浸润、间质纤维化、肾小管萎缩三方面对肾小管间质损伤程度进行半定量分析，每项参数积分值为0～3分，总计0～9分。具体评定标准:无明显病变，0分；病变＜25%，1分；病变25% ～50%，2分；病变 ＞50%，3分。

1.4.2 免疫组化检测PCNA、FN阳性细胞表达 采用免疫组化SABC法，以光镜下肾脏组织出现棕黄色颗粒为阳性表达。PCNA阳性细胞计数:在每个肾脏皮质切片中，观察10个连续不同的200倍视野，以每个视野平均阳性细胞数作为比较指标。

1.4.3 Western Blot检测PCNA、FN蛋白表达 肾组织匀浆，提取蛋白后电泳，转膜。2%牛奶封闭，加入一抗稀释液(1∶500)，4℃过夜，PBS-Tween洗膜3次，再加入HRP标记的二抗稀释液(1∶5000)，孵育1 h，PBS-Tween充分洗膜后，显影，用富士LAS-4000 LIMINESCENT图像分析仪拍照。

1.4.4 RT-PCR检测PCNA、FN mRNA表达 PCNA上游引物5'-CAG CAA GAC CTC GCT CCC CT-3'，下游引物5'-TCC CAT TGC CAA GCT CCC CA-3'，扩增片段长度为593 bp；FN上游引物5'-CAC CTC GAG CCC GGA TAG CA-3'，下游引物5'-TCT CTC TCC TGG CCG TCC CT-3'，扩增片段长度为433 bp；β-actin 上游引物5'-CAC GGT GTC ACC CAG ACC CG-3'，下游引物5'-AGC AGA GGC AGT GGC AGA CT-3'，扩增片段长度为273 bp。产物电泳后，紫外灯下拍照，用BIO-PROFIF凝胶图象分析系统进行分析。

1.4.5 流式细胞术检测细胞周期 制作单细胞悬液，加入兔抗鼠PCNA抗体，室温孵育后加入PBS洗涤，弃上清，加羊抗鼠FITC-IgG二抗，避光室温孵育，加入PBS离心，弃上清(以除去未结合的荧光二抗)，过滤后上机检测。采用美国BD公司FACS 420型流式细胞仪检测细胞周期，用DNA细胞周期分析软件，计算出DNA组方图各时相分布的百分比，并根据公式:(PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%计算出增殖指数(PI)。

2 结果

2.1 肾脏病理 HE染色显示:对照组未见明显异常；模型组肾间质大量炎性细胞浸润，肾小管上皮细胞坏死、脱落，肾小管萎缩；柴苓汤组及缬沙坦组病变程度明显轻于模型组。Masson染色显示:对照组肾间质可见少量胶原成分。模型组肾间质胶原成分大量沉积，并呈条带状分布；柴苓汤及缬沙坦组肾间质胶原成分较模型组明显减少。半定量分析结果表明，模型组肾小管间质损伤各项参数积分值均明显高于对照组(P＜0.01)，与之相比，两治疗组各项积分值则明显降低(P＜0.05，P＜0.01)。见表1。

表1 各组大鼠肾间质损伤半定量评分 (，n=10)

表1 各组大鼠肾间质损伤半定量评分 (，n=10)

注:与对照组相比，＊＊P＜0.01；与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别 炎细胞浸润积分 间质纤维化积分 肾小管萎缩积分 总积分对照组0.20±0.42 0.40±0.52 0.10±0.32 0.70±0.48模型组 2.60±0.52＊＊ 2.50±0.71＊＊ 2.50±0.53＊＊ 7.60±1.17＊＊柴苓汤组 1.50±0.53△△ 1.80±0.63△ 1.30±0.48△△ 4.60±1.07△△缬沙坦组 1.20±0.42△△ 1.70±0.48△△ 1.70±0.67△△ 4.60±0.97△△

2.2 免疫组化 PCNA表达情况:对照组肾小球和肾小管仅见少量PCNA阳性细胞。模型组阳性细胞较对照组明显增多(P＜0.01)。柴苓汤及缬沙坦组PCNA阳性细胞较模型组显著减少(P＜0.01)，但两治疗相比无明显差异。见图1，表2。FN表达情况:对照组FN仅在肾小管上皮细胞少量表达；模型组呈强阳性表达，染色明显加深；经柴苓汤及缬沙坦治疗后，肾小管FN表达明显减少。见图2。

图1 免疫组化检测大鼠肾脏PCNA阳性细胞表达 (×200)

2.3 Western Blot 对照组肾组织PCNA、FN蛋白仅少量表达，与之相比，模型组表达增强，柴苓汤组及缬沙坦组较模型组显著减弱。见图3。

2.4 RT-PCR 与对照组相比，模型组PCNA、FN mRNA表达明显增强(P＜0.01)。柴苓汤及缬沙坦可下调这种高表达(P＜0.05，P＜0.01)，两治疗组基因表达无明显差异。见图 4，表 3。

表2 免疫组化检测大鼠肾脏PCNA阳性细胞数目(，n=10)

表2 免疫组化检测大鼠肾脏PCNA阳性细胞数目(，n=10)

注:与对照组相比，＊＊P＜0.01；与模型组相比，△△P＜0.01。

组别 PCNA 阳性细胞数对照组3.90±2.38模型组 37.30±5.38＊＊柴苓汤组 21.00±3.83△△缬沙坦组 19.90±3.96△△

图2 免疫组化检测大鼠肾脏FN阳性细胞表达 (×200)

2.5 流式细胞术 模型组处于S期的细胞比例较对照组增多(P＜0.01)，而处于G0/G1期的细胞比例较对照组减少(P＜0.01)；柴苓汤及缬沙坦组处于S期的细胞比例较模型组明显降低(P＜0.01)，处于G0/G1期的细胞比例较模型组增多(P＜0.01)。各组G2/M期细胞比例相对接近，组间比较无统计学差异。模型组PI较对照组明显提高，与模型组比较，柴苓汤组及缬沙坦组PI显著下降(P＜0.01)，但后两组比较无显著差异(P＞0.05))。见表4。

图3 Western Blot检测大鼠肾脏PCNA、FN蛋白表达

图4 RT-PCR检测大鼠肾脏PCNA、FN mRNA表达

表3 RT-PCR检测大鼠肾脏PCNA、FN mRNA表达 (，n=10)

表3 RT-PCR检测大鼠肾脏PCNA、FN mRNA表达 (，n=10)

注:与对照组相比，＊＊P ＜0.01；与模型组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别PCNA/18S FN/18S对照组0.71±0.06 0.89±0.03模型组 1.21±0.11＊＊ 1.21±0.02＊＊柴苓汤组 0.90±0.19△ 0.91±0.03△△缬沙坦组 0.98±0.04△ 1.02±0.04△△

3 讨论

肾间质纤维化是慢性环孢素A肾病的主要病理特征，而细胞外基质(ECM)沉积是肾间质纤维化的重要病理基础。ECM合成降解失衡以致大量蓄积与细胞增殖有关。研究表明，诱导细胞增殖，则ECM分泌增多，而抑制细胞增殖，则可使ECM蓄积减少［3］。环孢素A激活RAS后，RAS的主要活性物质血管紧张素II(AngⅡ)大量分泌，并通过与其I型受体(AT1受体)结合诱导肾小管上皮细胞、系膜细胞增殖，进而引起胶原蛋白、FN等ECM成分合成增加，降解减少，最终导致肾间质纤维化和肾小球硬化。因此，细胞增殖在肾纤维化的发生发展中发挥了重要作用［4-6］。

表4 流式细胞术检测大鼠肾脏细胞周期的情况(，n=3)

表4 流式细胞术检测大鼠肾脏细胞周期的情况(，n=3)

注:与对照组相比，＊＊P＜0.01；与模型组相比，△△P＜0.01。

级别 S期/% (G0/G1)/% (G2/M)/%PI/%对照组7.67±2.25 84.57±1.91 7.80±1.49 16.37±2.04模型组 30.10±2.50＊＊ 60.67±2.14＊＊ 9.21±1.15 39.32±2.15＊＊柴苓汤组 19.93±3.16△△ 72.30±4.16△△ 7.80±1.35 27.72±4.19△△缬沙坦组 17.83±0.59△△ 74.69±1.31△△ 7.94±0.71 25.66±0.07△△

PCNA是一种与细胞增殖密切相关的核内蛋白，伴随增殖活动而表达，因此被认为是细胞增殖的标志物，用于评价细胞的增殖状态［7-8］。动物实验表明，正常成年大、小鼠肾脏的各部分增殖活动并不十分活跃，PCNA在肾小管和肾小球仅有少量表达［9］。当肾脏受到损伤时，PCNA表达会显著增加［10］。PCNA适量增加是对损伤组织的修复，但过度增加促进了脏器硬化的进展。PCNA是细胞周期依赖性蛋白，在细胞周期的各个阶段合成、表达不同:G1期表达很少，S期达到高峰，G2和M期明显下降［11］。其中G1-S是整个细胞周期的关键点，能够对复杂的细胞内外信号进行整合与传递，保证细胞周期的正常进行［12］。FN属于一种非胶原性糖蛋白，与细胞增殖、分化、黏附等活动关系密切。作为ECM的主要成分，其表达水平在一定程度上可以反应ECM的积聚程度，在大多数肾小球硬化及肾间质纤维化病变中都可观察到它的过度分泌。因此，FN可作为检测肾纤维化的主要指标之一。本研究从蛋白、基因多角度地检测到PCNA与FN在慢性环孢素A肾病大鼠肾脏组织中呈高表达状态。因此，抑制PCNA、FN的过度表达，对于减轻ECM增生性损伤意义重大。流式细胞术检测结果表明，与对照组相比，模型组大鼠处于S期的细胞比例增多，增殖指数明显提高。这提示，环孢素A具有促进细胞有丝分裂，诱导肾脏细胞增殖的作用。

本实验同时观察到，柴苓汤与血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂缬沙坦疗效相近，均可明显减轻环孢素A诱导的肾组织病理损害，并下调 PCNA、FN的高表达，阻止细胞由G0/G1期进入S期，降低细胞增殖活性。柴苓汤由五苓散和小柴胡汤相合而成:五苓散通阳化气、健脾利水，小柴胡汤和畅气机、疏利三焦，二方相合，有疏肝健脾利水之效。研究表明该方可抑制系膜增生性肾小球肾炎大鼠尿蛋白排泄及炎症细胞浸润［13］，并可明显减少肾组织α-SMA的表达，有效抑制肾小管上皮细胞的表型转化［14］。本实验结果显示，柴苓汤可通过调节细胞周期抑制环孢素A诱导的细胞增殖，从而延缓肾脏纤维化进程。

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