芦笋水解氨基酸的测定

姜云云， 叶光明*， 范国荣， 陈云红， 潘小明， 沐 韦

（1.中国人民解放军第101医院，江苏 无锡 214044；2.第二军医大学药物分析教研室，上海 200433）

芦笋Asparagus officinalis L.为百合科天门冬属植物，学名石刁柏，又名芦荀、龙须菜、细百叶部等。现代研究表明芦笋具有抗肿瘤、抗真菌、抗病毒、降血脂等活性，是理想的绿色保健食品［1-3］。芦笋中含有丰富的多糖、黄酮、氨基酸等活性成分，是芦笋发挥药理药效的物质基础。

目前对芦笋氨基酸的研究已有相关文献报道，安玉会等［4］采用氨基酸自动分析仪对芦笋口服液中的氨基酸进行了分析，所用仪器昂贵、测定成本较高，不适合推广应用；邵旭等［5］用柱前衍生HPLC法测定了芦笋中的门冬氨酸，该方法采用了专门的氨基酸分析柱，且只测定了一种氨基酸，不能系统评价芦笋中氨基酸的分布。本实验采用柱前衍生化法测定芦笋中的11种氨基酸，所用方法简单易行、测定结果准确，且无需特殊设备，该法可用于芦笋氨基酸成分的质量控制。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 岛津LC-10A系列高效液相色谱仪，包括 LC-10ATvp泵，SCL-10Avp系统控制器，SIL-10ADvp自动进样器，CTO-10ASvp柱温箱，SPD-10vp紫外检测器，工作站为岛津 CLASS-VP。SK7200H超声仪(上海科导超声仪器有限公司)，HA-202M 电子天平(A＆D Company LTD.)。

1.2 试药 氨基酸标准品(BDH Chemical LTD，Poole England)，衍生化试剂6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯 (AQC)及缓冲液(Waters公司)，乙腈为色谱纯(克莱顿，加拿大)，磷酸和三乙胺为分析纯(上海化学试剂有限公司)，水为自制去离子水(18.2 MΩ)。芦笋鲜品购于当地超市，产地福建，经第二军医大学药学院生药教研室张巧艳教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液配制 分别称取组氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、缬氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸适量，用0.1 mol/L盐酸配成质量浓度均为1 mg/mL的混合标准品贮备液。该贮备液再用水稀释成含上述各氨基酸均为20 μg/mL的混合标准对照溶液，即得。

2.2 供试品溶液的配制 称取新鲜芦笋匀浆液0.8 g置5 mL量瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液至刻度，混匀，将该混悬液移至安瓿瓶中，用氮气将安瓿瓶中的空气赶净，封口，于110℃放置24 h水解，取水解液 1 mL于 10 mL量瓶中，加入1.2 mol/L NaOH溶液5 mL，混匀，并用水定容至刻度，经0.45 μm滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.3 氨基酸衍生化反应［6］精密吸取对照品溶液或供试品溶液50 μL于0.5 mL离心管中，加入350 μL缓冲液，涡旋10 s，再加入100 μL衍生化试剂，涡旋10 s，于55℃烘箱中放置10 min，取出冷至室温，于4℃冰箱保存待测。

2.4 色谱条件 Diamonsil®(钻石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)(Dikma Technologies)；采用梯度洗脱，流动相 A为磷酸-三乙胺-水(0.3∶0.5∶100)，流动相B为乙腈-水(60∶40)，洗脱程序见表1；检测波长248 nm；柱温37℃；进样量10 μL；体积流量1.0 mL/min。

表1 流动相梯度程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.5 专属性试验 以水代替芦笋匀浆液按2.2项下制备空白样品液，按2.3项下进行衍生化反应，在上述色谱条件下进样，结果见图1。空白样品液对待测氨基酸的分离没有干扰，方法专属性良好。

2.6 线性考察 配制系列质量浓度的混合氨基酸标准溶液，分别衍生化反应后进高效液相色谱仪检测，记录各氨基酸衍生化产物的色谱峰面积，与各自质量浓度进行线性回归，结果见表2。

2.7 精密度试验 取对照品溶液，衍生化反应后连续进样5次，记录各氨基酸衍生化产物的色谱峰面积值，结果各氨基酸的RSD值均小于1.5%。

2.8 重复性试验 取同一批芦笋样品，按2.2项下平行制备5份样品溶液，衍生化反应后分别进高效液相色谱仪检测，记录各氨基酸衍生化产物色谱峰面积值并计算质量分数，结果各氨基酸的RSD值均小于3.0%。

2.9 稳定性试验 取芦笋匀浆液，按2.2项下制备供试品溶液，衍生化反应后分别于 0、1、2、4、6、8 h检测，记录各氨基酸衍生化产物色谱峰面积值，结果各氨基酸的RSD值均小于1.5%，表明样品在衍生化反应后8 h内稳定。

2.10 回收率试验 采用加样回收试验。取6份已知氨基酸质量分数的芦笋匀浆液，各加入对照品溶液适量，按2.2项下处理并进行衍生化反应，进高效液相色谱仪检测，计算回收率，结果见表3。

2.11 样品测定 取10批芦笋样品，按2.2项下配制供试品溶液，测定其中11种氨基酸，结果如下:组氨酸2.97‰ ～5.56‰，甘氨酸0.39‰ ～0.53‰，天冬氨酸1.64‰ ～3.63‰，谷氨酸0.89～1.55‰，苏氨酸0.32‰ ～0.46‰，丙氨酸0.32‰ ～0.57‰，胱氨酸0.47‰ ～1.01‰，酪氨酸0.23‰ ～0.28‰，缬氨酸0.36‰ ～0.65‰，亮氨酸0.37‰ ～0.60‰，苯丙氨酸0.35‰～0.44‰。

图1 芦笋氨基酸的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids in Asparagus officinalis L

表2 11种氨基酸的线性考察Tab.2 Linearity test of 11 amino acids

表3 回收率试验结果Tab.3 Results of recovery test

3 讨论

氨基酸是广泛存在于植物体内的一种含氮物质，是构成生物体蛋白质分子的基本单位，也是蛋白质消化后的最终产物，在生物体内具有特殊的生理功能，对人体疾病治疗和保健具有重要价值。芦笋中的氨基酸成分比较丰富，品种齐全，富含必需氨基酸和药效氨基酸，具有很高的营养价值和保健作用［7］。

氨基酸的测定方法较多，其中，氨基酸分析仪虽然操作简便，但价格昂贵，使用成本高，不适合普及［8-10］。柱前衍生化法目前应用较为广泛，衍生化试剂品种繁多［11-12］，本实验采用的HPLC-AccQ-Tag法是Waters公司专为柱前衍生高效液相分析氨基酸而开发的创新方法。其核心在于名为AQC的专利衍生剂能与所有含氨基的化合物发生快速、定量反应，过量的AQC可在1 min内水解为不干扰测定的AMQ，生成的衍生物稳定。Waters公司为该法配备了专门的氨基酸分析柱和相应的流动相洗脱程序，但考虑到氨基酸分析柱价格昂贵，适用范围窄等缺点，本实验采用普通的C18柱进行分离，所用流动相也作了相应调整，结果也能获得较为满意的分离效果，使得该法具有更强的适用性。

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