RP- HPLC法测量药物有关物质的不确定度评定

乐立源，葛朝霞

（邵阳市食品药品检验所，湖南 邵阳 422001）

高效液相色谱法被广泛应用于药品的有关物质检查中，由于本法不需要杂质对照品，当无法获得杂质对照品时，本法成为最佳检查计算有关杂质的含量的方法。不加校正因子的主成分自身对照法可以解决面积归一化法中可能出现的仪器检测范围和线性范围问题，而且操作简单、运算方便，无需杂质对照品；缺点是本法会存在稀释步骤、进样针和进样阀残留、进样误差等影响因素，往往也会导致计算出的杂质与真实含量之间存在一定的误差［3］。而一般有关物质检查限度通常较低，大多数为1%左右。面对这样一个限度值，什么样的检出数值才是可信值，误差范围有多大，什么样的结果才能放心发出报告，本文试着从测量不准确度方向出发，分析有关物质结果误差范围的问题，偿试找出误差原因，为药检所日常检验提供依据。

1 测量原理及方法

有关物质检查所用的方法多为药典附录VE第四法“不加校正因子的主成分自身对照法”。不加校正因子的主成分自身对照法本法是配制一个浓度与杂质限度相当的供试品溶液作为对照溶液，一般是由供试溶液直接稀释得到，通常稀释100倍（限度1%）。对照溶液有二个用途：一是用来调节仪器的灵敏度，二是用于与供试品溶液色谱图上的杂质峰面积进行比较（相当于一个外标），以计算杂质的含量。

2 数学模型

其中X——药品中所含有关杂质比例（百分比）；

A杂——药品中检出有关杂质峰峰面积（mAU＊sec）；

A标——标准溶液中主成分峰峰面积（mAU＊sec）；

F——对照溶液的稀释倍数。

3 不确定度来源分析

由公式1得知，测量药品中有关物质的量的不确定度主要来源于几个方面：①重复性测量所得到的不确定度（Ur（R））；②对照溶液稀释过程引入的不确定度（Ur（V））；③测量仪器带来的不确定度（Ur（A））；④样品均匀性引入的不确定度（Ur（U））。

4 不确定度各分量的评定

4.1 重复测量引入的不确定度评定

测量过程中的随机因素对测量结果反映在一组重复性测量的条件下获得的观测列中，通过这样一组观测列可以计算由重复性引入的不确定度。本实验按照药典标准方法 对某一样品进行10次重复检测，测量结果见表1。

表1 药品有关物质检测结果

一般来说，有关物质检查都是以两次测量结果的平均值计算的，故重复检测引入的不确定度为：

重复性测量引起的相对不确定度为：

4.2 稀释倍数引入的不确定度

对照溶液的配制是在室温（10℃～30℃）条件下配制的，温度呈均匀分布，根据经验可知，温度引入的不确定度较小，可以忽略不计；此过程的不确定度主要由稀释过程中使用容器或量器引入的，主要稀释步骤如下：

对照溶液的配制：用1mL的移液管量取供试溶液1.00mL，用流动相定容至100mL容量瓶中，得到对照溶液。

由此可知，对照溶液稀释过程中引入的不确定度分量主要有以下几个方面：

UV1：对照溶液配制过程中使用1mL移液管引入的不确定度；

UV2：对照溶液配制过程中使用100mL容量瓶引入的不确定度；

在实验中使用的均为A类玻璃器具，根据JJG-196-2006《常用玻璃仪器检定规程》［4］规定：1mL移液管容量允许误差为±0.007mL；100mL容量瓶容量允许误差为±0.01mL。不确定度评定中，一般采用三角分布，K ＝，则标准溶液的配制过程中各种量器引入的相对不确定度为：

合成配制过程中量器引入的相对不确定度为：

4.3 测量仪器带来的不确定度

根据JJG705-2002《液相色谱仪检定规程》［5，6］高效液相色谱仪带来的误差最大不超过±3%。不确定度评定中，一般采用矩形分布，K ＝，则液相色谱仪引入的不确定度为

4.4 样品不均匀性引入的不确定度

不均匀性体现了样品特性量值存在分散性，可以通过一个修正因子来反映，数学期望值应为1，但其不确定度却不为零，同批内药品质量相对一致，而通过重复测量应已把不均匀性引入的不确定度包含在内，故不确定度不再计算。

5 计算合成不确定度

计算合成相对不确定度为：

计算合成标准不确定度：

6 扩展不确定度

取包含因子K＝2，计算扩展不确定度：

7 检测结果与报告表示

检得有关物质结果可以表示如下：

8 讨论

从测量不确定度结果可以得出，检测结果为1%，不确定度带来的误差可达到0.074%之多，约占结果的7.4%，换而言之，如果测量结果出现在（0.926%，1.074%）区间内，那么这个结果一定是可疑值，也就是药检系统常说的边缘值，如果要发出这样的报告书，所要遇到的报告书错发风险将是最大的。将各不确定度分量绘图（见图1）。

图1 不确定度分量

由图1可以看到，稀释过程引入的不确定度分量最小，仪器因素与重复测量所引入不确定度对总不确定度贡献最大。试分析这两个因素：仪器因素完全取决于仪器本身精度与日常维护，液相色谱仪每年的计量检定与期间核查是仪器是否工作正常的最大保障。重复测量因素取决于两点人员操作。人员操作因素关键在于实验室规范操作与人员素质，相信这个相对于大多数药检所来说已经不是问题。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典 ［M］.北京：中医药科技出版社，2005：149.

［2］JJF1059-2010测量不确定度评定与表示 ［S］.2010.

［3］余振喜，庚莉菊，黄海伟，等.浅谈HPLC法测定有关物质时已知杂质的计算方法［J］.中国药品标准，2010，11（4）：278-282.

［4］JJG-196-2006常用玻璃仪器检定规程 ［S］.2006.

［5］JJG705-2002液相色谱仪检定规程 ［S］.2002.

［6］郑宗寅，吴惠英.液相色谱仪测量结果的不确定度评定 ［J］.科技创新导报，2010，12（4）：45.