超高压处理对纳豆香气物质的影响

马善丽，叶 庆，许 颖，袁小单，邓娜娜，马永昆*

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

超高压处理对纳豆香气物质的影响

马善丽，叶 庆，许 颖，袁小单，邓娜娜，马永昆*

(江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013)

研究超高压处理对纳豆风味的影响。纳豆经200、400MPa和600MPa超高压处理10min后，采用固相微萃取富集香气，并用气相色谱-质谱联用仪检测香气成分。结果表明：超高压处理后纳豆香气物质的种类和含量变化显著(P＜0.05)，2-甲基-3-戊酮含量下降至未检出，并新增己醛、2-戊基呋喃两种物质；酮类、酯类和醇类含量呈现不同的增加趋势，酸类、醛类和吡嗪类含量下降，其中400MPa处理10min后，酮类、酯类和醇类含量分别上升13.11%、117.29%和46.91%，酸类、醛类和吡嗪类含量分别下降50.59%、90.92%和16.17%，纳豆香气典型，且更加突出，而对风味有不利影响的乙酸、苯甲醛等含量显著下降(P＜0.05)。

纳豆；超高压；香气；固相微萃取；气相色谱-质谱法

纳豆是日本一种独特的大豆传统食品，类似中国的豆豉，是大豆经枯草芽孢杆菌发酵而成的具有独特风味的一种食品，其含有纳豆激酶、氨基酸、VK2、γ-谷氨酰基转肽酶和α-多聚谷氨酸等物质[1]，具有溶血栓[2]、抗氧化延缓衰老[3]、预防骨质疏松[4]和降血压[5]等保健功效。但是由于新鲜纳豆具有氨味，难以被我国消费者接受，因此改善纳豆的风味成为其在我国推广努力的方向。Tanaka等[6]研究表明纳豆的特征香气成分主要是丙酮和异丁酸甲酯；Leejeerajumnean等[7]研究发现丁酮、3-羟基-2-丁酮、2-甲基-丁酸、2-戊基呋喃和吡嗪类物质是纳豆的主要香气物质，且干燥后纳豆与新鲜纳豆相比，其风味物质含量损失65%，而且其营养物质也会损失。Allagheny等[8]研究表明在纳豆发酵初期加入保湿剂(如NaCl等)、在发酵过程中减少氧气的通入量或在低温下贮存，可以减少水分活度、蛋白水解和氨水的形成，改善风味；Mu等[9]研究表明在豆豉发酵时加入的盐分浓度不同，发酵结束产生的氨水浓度也不同，因此需要一种既可以减少氨水浓度而又不损失营养物质的方法。

近年来，国内外研究表明超高压处理可以引起食品成分非共价键(氢键、离子键和疏水键等)的破坏或形成，使食品中的酶、蛋白质和淀粉等生物高分子物质分别失活、变性和糊化，并杀死食品中的细菌等微生物，同时能较好的保持食品的色香味和营养物质，从而达到食品灭菌、保藏和加工的目的[10-12]。本实验利用超高压处理纳豆，检测其处理前后香气成分的变化，以期待对纳豆的成分进行转化使其得到较为满意的风味，为改善纳豆风味、提高其在我国的接受度提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄豆 哈尔滨市农业科学研究所；纳豆菌冻干粉为本实验室分离并采用超高压诱导获得。

1.2 仪器与设备

3L智能化超高压食品处理装置 江苏大学超高压食品研究所；固相微萃取装置、萃取纤维头100μmDVB/CAR/ PDM 美国Supelco公司；HP6890 /5973型气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；手动式塑料薄膜封口机 浙江省永嘉水电机械厂；高压蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司；无菌操作台 苏州净化设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 纳豆制备方法

制备步骤：黄豆→浸泡过夜(10h)→高温蒸煮(121℃，15min)→接种(0.1%冻干粉)→培养(40℃，24h)→后熟(4℃，24h)→聚乙烯袋包装→置于4℃备用。

1.3.2 纳豆超高压处理

在室温下，样品经200、400MPa和600MPa超高压处理10min，对应样品编号为A200MPa、A400MPa和A600MPa，空白样品编号为A空白。处理后的样品在4℃保藏并在24h内检测。

1.3.3 固相微萃取(solid-phase microextraction，SPME)

将首次使用的DVB/CAR/PDMS固相微萃取头在气相色谱进样口老化至无杂峰(约30min)。称取5g新鲜纳豆放入15mL顶空瓶中，在50℃加热平台上保持10min，将DVB/CAR/ PDMS萃取头插入瓶中，使之与样品表面保持1.5cm间距，50℃萃取30min。

1.3.4 气相色谱-质谱联用仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)参数条件及分析

色谱条件：色谱柱：DB-WAX柱(60m×0.25mm，0.25μm)；色谱条件：PDMS萃取头解吸0min，进样口温度 280℃，载气为高纯氦气，流量1.1mL/min，不分流。程序升温：起始温度40℃，保持2min，以5℃/min的速度升至 120℃，再以12℃/min的速度升至 220℃，保持10min。

质谱条件：5973型四极杆质谱仪，接口温度 250℃、电子电离(electron ionization，EI)离子源、电子能量为70eV；电子倍增器电压：1353V；离子源温度：230℃；四极杆温度：150℃；质量扫描范围m/z33～350。

定性、定量方法：数据收集用HP化学工作站软件对照NIST 98库进行，成分先由谱库初步鉴定，再结合保留时间、质谱和相关文献进行定性。采用峰面积归一化法定量。

2 结果与分析

2.1 纳豆香气成分总离子流图

纳豆经不同超高压条件处理后，经GC-MS检测得到总离子流图如图1所示。

图1 超高压处理前后纳豆香气成分总离子流图Fig.1 GC-MS total ion current chromatograms for untreated and UHP-treated Natto

2.2 纳豆香气成分构成及其主体成分分析

从表1可以看出，未经超高压处理的纳豆共鉴定出3 1种香气成分，主要由醇类、酯类、酮类、酸类和吡嗪类物质等构成，根据Guadagni香气值理论[13-14]，食品中香气浓度高而阈值低的成分很可能是食品的特征香气或主体香气成分，结合表1，己醇、1-辛烯-3-醇、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、2-庚酮和异丁酸甲酯等物质含量高阈值低，它们的阈值分别是250、1、800、2.3、140μg/kg和7μg/kg，虽然2,5-二甲基吡嗪、丙酮阈值为1500μg/kg和500000μg/kg，但是这两种物质含量很高，因此这些物质都为纳豆的主要香气成分，与Tanaka等[6]、Leejeerajumnean等[7]检测到的纳豆主要香气成分基本相同，它们呈现出酿香、奶制品香、青香和焦糖香等混合组成了纳豆独特的香气。

2.3 超高压处理对纳豆香气的影响

经超高压处理后，纳豆香气物质的种类和含量都发生了显著变化(P＜0.05)。经超高压处理后新增己醛、2-戊基呋喃等4种物质，而2-甲基-3-戊酮含量下降至未检出；酮类、酯类和醇类含量有不同程度的增加，酸类、醛类、吡嗪类含量下降；对风味有不利影响的乙酸、苯甲醛等含量显著下降(P＜0.05)。

2.3.1 吡嗪类、呋喃类

图2 2,5-二甲吡嗪和四甲基吡嗪的合成代谢途径Fig.2 Total ion current chromatogram of Gas Chromatography-Mass Spectromety(GC-MS)of untreated natto and after HPP

吡嗪类物质含量占香气总含量的20%，经400MPa超高压处理10min后，吡嗪类含量下降16.17%，其中2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪呈烤香、咖啡香及坚果香，此外，四甲基吡嗪对心脏、冠脉循环和血压调节都有一定的作用，它们在纳豆风味中起重要作用，吡嗪类物质是大豆在发酵过程中由苏氨酸、3-羟基-2-丁酮经一系列反应生成的[15]，过程如图2所示。经超高压处理后吡嗪类物质发生了不同程度的下降，其中200、400MPa含量显著降低(P＜0.05)，分别降低了17.6%、16.2%，600MPa处理含量降低了7.1%。其原因是超高压处理可能会使苏氨酸脱氢酶、5-氨基酮戊酸脱水酶钝化甚至失活，影响吡嗪类物质的生成。

2-戊基呋喃是大豆豆味的主要成分，在新鲜纳豆中未检出呋喃类物质，但是经400、600MPa处理可以检测到2-戊基呋喃的产生。

2.3.2 酮类、酯类

酮类物质的含量经400MPa超高压处理10min后上升了13.11%，其中3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、丙酮和2-庚酮具有果香、甜香和奶制品香，是纳豆的主要香气成分。其中3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮是在发酵时以葡萄糖或柠檬酸为底物，生成的一系列风味化合物[13,15]。3-羟基-2-丁酮和2,3-丁二酮在200MPa处理时含量分别下降65%、9%，400MPa对3-羟基-2-丁酮没有显著影响(P＞0.05)，而2,3-丁二酮则下降23.4%，在600MPa处理时分别上升37.4%、20.6%。这可能是由于600MPa较200、400MPa能量和温度都较高，提高了物质的浓度，缩短分子之间的距离，导致化学反应活性的提高，使物质含量增加[16]。2-庚酮在200、400MPa时分别上升81%、82%，而在600MPa时下降16%。丙酮经200、400MPa及600MPa 处理后含量发生显著变化(P＜0.05)，分别增加103.8%、61.7%和6.9%。

酯类经超高压200、400MPa和600MPa处理后分别增加66%、117%和13%，其中异丁酸甲酯具有果香、醚香等水果香气，是纳豆的主要呈味物质，经超高压处理之后分别提高1.38、3.25倍和1.75倍，表明经超高压处理之后酯香气突出，400MPa处理后含量增加最多。

2.3.3 醛类、酸类

醛类物质的含量经400MPa超高压处理10min后下降了90.92%，其中苯甲醛是纳豆中的主要醛类物质，其具有苦杏仁味，含量过高会影响纳豆特有的香气，对其产生不利的影响。苯甲醛经超高压处理后含量显著下降(P＜0.5)，200、400MPa及600MPa处理苯甲醛含量分别降低82.5%、93.6%和63.4%，原因可能是由于较低压力对一些酶有激活作用，这些酶激活后会破坏香气成分使其发生降解，而600MPa处理虽然可以使酶失活钝化，减少降解的作用，但是较高压力可以使物质浓度增加，加速反应的进行，促进物质间的转化[17]，形成新物质——己醛。

酸类物质的含量经400MPa超高压处理10min后下降了50.59%，其中乙酸具有刺激尖酸的气息，经过超高压处理后会使其含量下降，减少纳豆中较刺激的气味，经200、400MPa和600MPa处理后乙酸含量分别降低58%、47%和76%。超高压处理可使酸、醇等物质的合成反应加速，生成一些酯类香气等[18]。但总体来说400MPa处理既可以减少乙酸的刺激气味，也可以使其和别的香气成分柔和在一起，改善纳豆的品质。

3 结 论

纳豆香气成分主要由醇、酯、醛、酮等41种成分组成，主要的香气成分为己醇、1-辛烯-3-醇、3-羟基-2-丁酮、2,3-丁二酮、2-庚酮、异丁酸甲酯、2,5-二甲基吡嗪、丙酮等。经超高压处理后纳豆香气的种类和含量都发生了较大的改变，酮类、酯类和醇类含量增加，酸类、醛类和吡嗪类含量下降；经400MPa处理10min后能较好地保留并改善纳豆的香气。因此，采用超高压处理纳豆的较佳条件是压力400MPa、保压时间10min。

[1] MUROOKA Y, YAMASHITA M. Traditional healthful fermented products of Japan[J]. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008, 35(8): 791-798.

[2] HSIA C H, SHEN M C, LIN J S, et al. Nattokinase decreases plasma levels of fibrinogen, factor Ⅶ and factor Ⅷ sin human subjects[J]. Nutrition Research, 2009, 29(3): 190-196.

[3] IWAI K, NAKAYA N, KAWASAKI Y, et al. Antiox idative functions of natto, a kind of fermented soybeans: effect on LDL oxida-tion and lipidmetabolism in cholesterol-fedrats[J]. J Agric Food Chem, 2002, 12(5): 3597-3601.

[4] IKEDA Y, IKI M, MORITA A, et al. Intake of fermented soybeans, natto,is associated with reduced bone loss in postmenopausal women: Japanese Population-Based Osteoporosis (JPOS) study[J]. J Nutr, 2006, 136(5): 1323-1328.

[5] JI Y K, SI N G, JEAN K P, et al. Effects of nattokinase on blood pressure: a randomized, controlled trial[J]. Hypertension Research, 2008,31(8): 1583-1588.

[6] TANAKA T, MURAMATSU K, KIM H, et al. Comparison of volatile compounds from Chungkuk-Jang and Itohiki-Natto[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(7): 1440-1444.

[7] LEEJEERAJUMNEAN A, DUCKHAM S C, OWENS J D, et al. Volatile compounds inBacillus-fermented soybeans[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2001, 81(5): 525-529.

[8] ALLAGHENY N, OBANU Z A, CAMPBELL-PLATT G, et al. Control of ammonia formation duringBacilhs subtilisfermentation of legumes[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 29(2/3):321-333.

[9] MU Guangqing, LI Hu, HOU Yingmin, et al. Comparison of volatile compounds in multi- strains douchi fermented in different salinity and strains[J]. Computer Science and Information Technology, 2010, 9(3):144-147.

[10] LAMBERT Y, DEMAZEAU G, LARGETEAU A, et al. Changes in aromatic volatile composition of strawberry after high pressure treatment[J]. Food Chemistry, 1999, 67(1): 7-16.

[11] 胡友栋, 励建荣, 蒋跃明. 超高压处理影响果蔬品质的研究进展[J].食品科学, 2009, 30(9): 235-240.

[12] YUSTE J, CAPELLAS M, PLA R, et al. High pressure processing for food safety and preservation: a review[J]. Rapid Methods and Automation in Microbioligy, 2001, 9(1): 1-10.

[13] 孙宝国. 食用调香术[M]. 北京: 化学工业出版社, 2003.

[14] 马永昆, 刘晓庚. 食品化学[M]. 南京: 东南大学出版社, 2007.

[15] LARROCHE C, BESSON I, GROS J. High pyrazine production byBacillus subtilisin solid substrate fermentation on ground soybeans[J].Process Biochemistry, 1999, 34(6): 667-674.

[16] YAYLAYAN V A, KEYHANI A. Origin of 2,3-pentanedione and 2,3-butanedione inD-glucose/L-alanine maillard model systems[J]. Agric Food Chem, 1999, 47(8): 3280-3284.

[17] RIVALAIN N, ROQUAIN J, DEMAZEAU G. Development of high hydrostatic pressure in biosciences: pressure effect on biological structures and potential applications in biotechnologies[J]. Biotechnology Advances, 2010, 28(6): 659-672.

[18] YAMAMOTO Y, FURUTA T, MATSUO J, et al. Cleavage of esters under nearly neutral conditions at high pressure chemo-and regioselective hydrolysis in organic solvents[J]. The Journal of Organic Chemistry,1991, 56(20): 5737-5738.

Effect of Ultra High Pressure Treatment on Aroma Compounds of Natto

MA Shan-li，YE Qing，XU Ying，YUAN Xiao-dan，DENG Na-na，MA Yong-kun*
(School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China)

The effect of ultra high pressure (UHP) treatment on the aromatic quality of natto was studied. Natto samples were treated at 200, 400 or 600 MPa for 10 min, and aromatic compounds were extracted by solid-phase microextraction (SPME) and analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that after UHP treatment, the types and contents of aroma compounds in natto had a significant change (P＜ 0.05). 2-Methyl-3-pentanone dropped to a undetectable level and another compounds such as hexanal and 2-pentyl furan were newly detected. The contents of ketones, esters and alcohols increased, while the contents of acids, aldehydes and pyrazines decreased. After UHP treatment at 400 MPa for 10 min, the contents of ketones, esters and alcohols revealed an increase by 13.11%, 117.29% and 46.91%, respectively; in contrast, the contents of acids, aldehydes and pyrazines exhibited a decrease by 50.59%, 90.92% and 16.17%, respectively. Following UHP treatment, more typical aroma of natto was achieved. The contents of acetic acid and benzene that have an unfavorable impact onthe aroma of natto revealed a significant reduction (P＜ 0.05).

natto；ultra high pressure (UHP) treatment；aroma compounds；solid-phase microextraction (SPME)；gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)

TS214.2

A

1002-6630(2012)16-0194-05

2011-06-21

江苏高校优势学科建设工程资助项目

马善丽(1988—)，女，硕士研究生，研究方向为超高压非热加工。E-mail：mashanli.199@163.com

*通信作者：马永昆(1963—)，男，教授，博士，研究方向为超高压非热加工及农产品加工技术。E-mail：mayongkun@ujs.edu.cn