酶法水解卵黄蛋白制备多肽的工艺优化

秦嘉炎，于 娜，岳喜庆*

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

酶法水解卵黄蛋白制备多肽的工艺优化

秦嘉炎，于 娜，岳喜庆*

(沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866)

利用酶法制备卵黄蛋白多肽。比较复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶水解卵黄蛋白的效果，确定碱性蛋白酶与复合风味蛋白酶为复合酶解的工艺用酶。采用响应面分析法，以水解度、多肽含量为响应值，研究加酶量、酶用量比、复合酶解时间比、pH值对制备多肽工艺的影响。结果表明：酶法水解卵黄蛋白制备多肽的最佳工艺条件为：卵黄蛋白质量浓度10g/100mL、温度55℃、pH7.2，按0.8g/100mL添加碱性蛋白酶水解2h后，再按0.4g/100mL添加复合风味蛋白酶水解2h，在该条件下水解度和多肽含量分别为(13.31±0.5)%和(1.85±0.5)mg/mL。

卵黄蛋白；多肽；酶解；响应面

鸡蛋作为一种完全食品，是人类健康、廉价、全价的重要蛋白来源，被人们誉为维持生命的营养食品[1]。鸡蛋黄是鸡蛋中营养价值最为丰富的一部分，蛋白质含量高，约占其总量的16%，且含有大量的生理活性物质，其生物学及生化性质相当引人注目，是食物中理想的蛋白质。鸡蛋黄生理功能成分的开发已成为国内外的研究焦点[2-3]。20世纪以来，许多学者已从鸡蛋黄中分离得到了多肽，目前已发现卵黄蛋白活性肽具有抗氧化[4]、降血压[5-6]、促进矿物质元素吸收[7]等多种生理功能，可广泛地应用于食品、保健品和医学等相关领域[8]，极具开发前景。为充分利用我国的禽蛋资源并提高它的经济价值，对其进行深加工研究显得尤为重要。目前，国内外研究多是从实验室的角度采用酶水解卵黄蛋白制备生物活性肽，但简便、易行、高产、低耗、高效的卵黄蛋白活性肽制备方法仍然是活性肽开发利用中一个亟待解决的问题。

本实验以卵黄蛋白为原料，利用多种蛋白酶对其进行酶解，并以水解度和肽含量为指标，研究酶法水解卵黄蛋白制备多肽的工艺，旨在为鸡蛋黄蛋白质的开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

卵黄蛋白(蛋白质含量72.5%) 自制。

碱性蛋白酶(Alcalase，酶活力2.4AU/g)、复合风味蛋白酶(Flavourzyme，酶活力500LAPU/g)、中性蛋白酶(Neutrase，酶活力0.8 A U/g)、复合蛋白酶(Protamex，酶活力1.5AU/g) 丹麦Novo公司；其他所用试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HZS-H水浴振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；CR-21G高速冷冻离心机 日本Hitachi公司；电子天平 沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；PHS-25型酸度计 上海理达仪器厂；85-2型恒温磁力搅拌器 杭州国华电器有限公司；UV-2100型分光光度计 龙尼柯(上海)仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质含量测定

采用凯氏定氮法[9]。

1.3.2 游离氨基氮含量测定

采用甲醛电位滴定法[10]。

1.3.3 水解度(DH)测定

参照文献[11-12]的方法。

式中：h为水解后每克卵黄蛋白被裂解的肽键毫摩尔数/(mmol/g)；htot为每克卵黄蛋白的肽键毫摩尔数/ (mmol/g)。

1.3.4 多肽含量的测定[13]

用10g/100mL三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白水解液中的大分子蛋白质，经离心过滤后，在上清液中加入双缩脲试剂，于540nm波长处测定其OD值，继而在Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准曲线上查出样品中的多肽含量。

1.3.5 卵黄蛋白的酶解工艺

准确称取一定量卵黄蛋白，加入适量蒸馏水配制成10g/100mL的底物质量浓度。经预处理(90℃加热10min)后冷却至设定温度，调节pH值至反应值，加入一定量的酶，在水浴恒温振荡器中进行酶解。酶解结束后，将酶解液在90℃条件下灭酶10min，然后于4000r/min离心10min，取上清液即为卵黄蛋白酶解液。

1.3.6 复合酶解最佳条件的确定

1.3.6.1 蛋白酶的筛选

取10g/100mL卵黄蛋白溶液100mL，分别加入碱性蛋白酶、复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、复合蛋白酶4种蛋白酶，并在其各自的最适温度、pH值、加酶量的条件下，分别水解4h。通过测定酶解液的水解度和多肽含量，确定适于水解卵黄蛋白的蛋白酶。

1.3.6.2 加酶方式的确定

选取两种酶解效果较好的酶制剂进行复合酶解实验，以研究加酶方式对酶解效果的影响。在确定两种蛋白酶适宜水解条件的基础上，将卵黄蛋白溶液质量浓度确定为10g/100mL，酶解温度55℃，复合酶解时间各为2h，在各自的最适加酶量、pH值条件下，考察协同水解和分步水解时两种加酶方式对酶解效果的影响。试图通过两种酶的复配，增加卵黄蛋白酶解液中多肽的含量和提高水解度，并改善卵黄蛋白酶解液的风味。

1.3.6.3 加酶量的确定

酶Ⅰ(碱性蛋白酶)的确定：在底物质量浓度10g/100mL、温度55℃、pH7.0、复合风味蛋白酶添加量0.4g/100mL、酶解2h的条件下，测定碱性蛋白酶不同添加量为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6g/100mL时，测定酶解液的水解度和多肽含量。

酶Ⅱ(复合风味蛋白酶)的确定：确定酶Ⅰ加酶量。固定其他条件，测定复合风味蛋白酶不同添加量为0.2、0.4、0.6、0.8g/100mL时，酶解液的水解度和多肽含量，以确定最佳总加酶量。

1.3.6.4 复合酶酶用量比的确定

在底物质量浓度10g/100mL、总加酶量1.2g/100mL、温度55℃、pH7.0、酶解时间各2h的条件下，测定m酶Ⅰ:m酶Ⅱ为3:1、2:1、1:1、1:2、1:3时，测定酶解液的水解度和多肽含量。

1.3.6.5 酶解时间比的确定

在底物质量浓度10g/100mL、总加酶量1.2g/100mL、m酶Ⅰ:m酶Ⅱ为2:1、温度55℃、pH7.0的条件下，测定t酶Ⅰ:t酶Ⅱ为1:2、1:3、2:1、2:2、3:1时，测定酶解液的水解度和多肽含量。

1.3.6.6 初始pH值的确定

在底物质量浓度10g/100mL、总加酶量1.2g/100mL、m酶Ⅰ:m酶Ⅱ为2:1、温度55℃、酶解时间各2h的条件下，初始pH值为6.0、7.0、8.0、9.0时，酶解液的水解度和多肽含量。

1.3.7 响应面中心组合试验设计[14-15]

根据Box-Benhnken响应曲面设计的中心组合试验设计原理，综合单因素的试验结果，选取碱性蛋白酶与复合风味蛋白酶复合酶解的m酶Ⅰ:m酶Ⅱ、pH值、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ进行三因素三水平的响应面分析试验，以水解度和多肽含量为响应变量对水解条件进行优化。试验因素水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of the optimization parameters used in response surface analysis

2 结果与分析

2.1 酶种类的确定

表2 4种蛋白酶水解效果的对比Table 2 Comparative effectiveness of four proteases in hydrolyzing egg yolk protein

由表2可知，4种蛋白酶水解卵黄蛋白的效果不同，其中复合风味蛋白酶的水解能力远远大于另外3种酶，酶解液无明显苦味、腥味，但水解产物中多肽含量相对较低；3种内切酶中，无论是从水解度还是肽含量考察，碱性蛋白酶的酶解效果最好，复合蛋白酶、中性蛋白酶次之，3种酶的水解产物均有苦腥味，且随着酶解时间的延长和水解度的提高，苦腥味不同程度地增强，这可能与酶切位点及卵黄蛋白中的氨基酸组成有关。通过比较研究，选用酶Ⅰ(碱性蛋白酶)和酶Ⅱ(复合风味蛋白酶)作为复合酶解的组合。

2.2 加酶方式对水解效果的影响

表3 复合酶解卵黄蛋白的不同酶解方案及结果Table 3 Experimental design and results for dual-enzymatic hydrolysis of egg yolk protein

由表3可知，酶Ⅰ、酶Ⅱ先后加入复合使用其水解度和多肽含量较高，酶解效果较其他方式好，离心分离后，上清液呈亮黄色、较澄清，酶解液的风味得到明显改善。可见这两种蛋白酶对卵黄蛋白的水解有互补作用。因此后续实验中均采用先酶Ⅰ后酶Ⅱ分步水解的方式水解卵黄蛋白。

2.3 加酶量对水解效果的影响

图1 碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶添加量对酶解效果的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage on the hydrolysis of egg yolk protein

由图 1a 可知，水解度及肽含量随着酶Ⅰ添加量增加而增加。当加酶量大于0.8g/100mL时，水解度及肽含量增势缓慢，且随加酶量的增加，酶解液的颜色加深，腥味加重。综合考虑成本和酶解效果等因素，选择酶Ⅰ添加量为0.8g/100mL。

由图1b可知，酶Ⅱ添加量对水解度和肽含量的影响不同。当酶Ⅱ添加量在0.2～0.4g/100mL时，水解度不断上升，肽含量达到较高水平；当加酶量超过0.4g/100mL时，水解度增加缓慢，多肽含量有所下降。这可能是因为酶解后期，酶Ⅱ主要以产物中存在的肽为底物，释放出更小分子质量的肽和氨基酸，使肽含量呈现下降趋势。综合各方面因素，选择0.4g/100mL为酶Ⅱ最适添加量，即总加酶量为1.2g/100mL。

2.4 复合酶酶用量比对酶解效果的影响

图2 酶用量比对酶解效果的影响Fig.2 Effect of alcalase-to-flavourzyme ratio on the hydrolysis of egg yolk protein

由图2可知，不同酶用量比对酶解液的水解度、肽含量影响较大。当m酶Ⅰ:m酶Ⅱ为2:1时，整体酶解效果较好，酶解液的风味得到明显改善。综合考虑酶解效果和酶解风味等因素，选择2:1为酶Ⅰ与酶Ⅱ的固定酶用量比。

2.5 酶解时间比对酶解效果的影响

由图3可知，当t酶Ⅰ:t酶Ⅱ为2:2时，水解度及肽含量均达到较高水平，酶解效果较好。综合考虑能耗、生产周期及酶解液的风味等因素，选择2:2为酶Ⅰ与酶Ⅱ的最适酶解时间比。

图3 复合酶解时间比对酶解效果的影响Fig.3 Effect of duration ratio between two hydrolysis steps on the hydrolysis of egg yolk protein

图4 pH值对酶解效果的影响Fig.4 Effect of pH on the hydrolysis of egg yolk protein

2.6 初始 pH值对酶解效果的影响由图 4可知，初始 pH值为 7.0～8.0时，酶解效果较好。但是pH值从7.0上升到8.0肽含量增幅较小，而且在实际生产中pH值的升高会增加脱盐的成本，因此确定初始pH值为7.0。

2.7 响应曲面法优化水解条件

2.7.1 回归方程的建立与检验

表4 响应面分析试验设计及结果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

响应面试验设计与结果见表4。应用MiniTab15计算机软件对表4中所得数据进行多元回归拟合分析，表5、6为方差分析结果，表明该模型回归显著。

表5 水解度回归方程的方差分析Table 5 Variance analysis for the developed regression equation for DH

表6 肽含量回归方程的方差分析Table 6 Variance analysis for the developed regression equation for polypeptide content

各因素经过回归拟合后，得到水解度(Y1)、肽含量(Y2)与三因素的二次多项回归方程分别为：Y1=12.9967＋0.833X1＋1.14613X2＋0.332625X3－0.894333X12－2.16558X22－1.25708X32－0.77725X1X2＋0.65775X1X3－1.076X2X3；Y2=1.80733＋0.114X1+0.176625X2+ 0.021125X3－0.146042X12－0.286292X22－0.161292X32－0.111X1X2＋0.095X1X3－0.18625X2X3。

由表5、6可知，以水解度和肽含量为响应值时，两个回归方程的P值均小于0.01，模型的决定系数分别为0.9674和0.9866，说明方程的因变量与自变量之间的回归效果显著，可以对试验进行分析和预测。失拟项均不显著，表明方程对试验拟合良好，试验误差小。

2.7.2 响应曲面分析

由均方分析可见，影响水解度、肽含量的三因素主次顺序均为pH值(X2)、m酶Ⅰ:m酶Ⅱ(X1)、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ(X3)。根据回归分析结果，可得到相应的曲面图，分别从中选取有代表性的两组，结果如图5所示。

图5 各因素对水解效果影响的响应面分析Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of threeprocess parameters on the hydrolysis of egg yolk protein

2.8 酶解工艺参数的优化及验证

运用Minitab软件的响应优化器对试验结果进行优化，得到水解度最高为13.31%的优化组合：X1=0.478、X2=0.131、X3=0.192，即酶Ⅰ与酶Ⅱ的添加量分别为0.85g/100mL和0.35g/100mL，pH7.13、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ为1.2:1；最高肽含量1.85mg/mL的优化组合：X1=0.230、X2= 0.253、X3=0.010，即酶Ⅰ与酶Ⅱ的添加量分别为0.68g/100mL和0.52g/100mL，pH7.25、t酶Ⅰ:t酶Ⅱ为1.01:1。综合各因素的影响大小和实际操作的便利，将工艺参数修正为：酶Ⅰ与酶Ⅱ的添加量分别为0.8g/100mL和0.4g/100mL、pH7.2、时间各2h、底物质量浓度10g/100mL、温度55℃。根据上述优化调整后的工艺参数进行验证实验，结果水解度为(13.31 ± 0.5)%、肽含量为(1.85 ± 0.5)mg/mL。实际值与预测值一致，说明预测条件与实际情况符合。可见，该模型可以较好的反映卵黄蛋白酶解的工艺条件，具有合理性和适用性。

3 结 论

实验通过比较复合风味蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶及复合蛋白酶对卵黄蛋白的酶解效果，最终确定碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶为复合酶解的较佳工艺用酶。通过单因素试验和响应面法优化试验设计，得出最佳工艺条件为：底物质量浓度10g/100mL、温度55℃、pH7.2，按先添加0.8g/100mL碱性蛋白酶水解2h后，再添加0.4g/100mL复合风味蛋白酶水解2h。该条件下水解度和多肽含量分别为(13.31±0.5)%和(1.85±0.5)mg/mL。

[1]马美湖. 我国蛋品工业科技成就、差距及发展前景的探讨[J]. 中国家禽, 2002, 24(19): 33-39.

[2]赵法利, 刘静波, 刘瑜, 等. 鸡蛋中功能成分的研究[J]. 食品科学, 2006, 27(12): 798-802.

[3]唐传核, 彭志英. 鸡蛋蛋黄活性成分的生理功能及开发[J]. 广州食品工业科技, 2000, 16(2): 53-55.

[4]SAKANAKA S, TACHIBANA Y, ISHIHARA N, et al. Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system[J]. Food Chemistry, 2004, 86(1): 99-103.

[5]YOSHII H, TACIH N, OHBA R, et al. Antihypertensive effect of ACE inhibitory oligopeptides from chicken egg yolks[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Parts C, 2001, 128(1): 27-33.

[6]廖丹葵, 万顺刚, 孙秀华, 等. 碱性蛋白酶水解制备蛋黄降压肽工艺条件的优化[J]. 食品科技, 2006, 31(8): 138-141.

[7]江波, MINE Y. 卵黄髙磷蛋白磷酸肽的制备及钙结合性质的研究[J].无锡轻工大学学报, 2000, 19(4): 325-330.

[8]MINE Y, KOVACS-NOLAN J. New insights in biologically active protein and peptides derived form hen egg[J]. World,s Poultry Science Journal, 2006, 62(1): 87-96.

[9]中华人民共和国卫生部. GB/T 5009.5—2003食品中蛋白质的测定[S]. 北京: 中国标准出版社, 2003.

[10]大连轻工业学院, 华南理工大学. 食品分析[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2007: 145-154.

[11]ADLER-NISSEN J. Enzymic hydrolysis of food proteins[M]. London: Elsevier Applied Science Publishers, 1986: 12-14.

[12]赵新淮, 冯志彪. 蛋白质水解物水解度的测定[J]. 食品科学, 1994, 15(11): 65-67.

[13]鲁伟, 任国谱, 宋俊梅. 蛋白水解液中多肽含量的测定方法[J]. 食品科学, 2005, 26(7): 169-173.

[14]吴有炜. 试验设计与数据处理[M]. 苏州: 苏州大学出版社, 2002: 135-142.

[15]杨文雄, 高彦祥. 响应面法及其在食品工业中的应用[J]. 中国食品添加剂, 2005(2): 68-71.

Process Optimization for Enzymatic Preparation of Polypeptides from Egg Yolk Protein

QIN Jia-yan，YU Na，YUE Xi-qing*
(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, China)

In this study, enzymatic hydrolysis was used to prepare polypeptides from egg yolk protein. Two-step hydrolysis with alkaline protease and flavourzyme was found optimal for preparing polypeptides from egg yolk protein as demonstrated by a comparison of the effectiveness of flavourzyme, neutral protease, alcalase and protamex in hydrolyzing egg yolk protein. The response surface methodology was employed to investigate the effects of total enzyme dosage, alcalase-toflavourzyme ratio, duration ratio between two hydrolysis steps and pH on degree of hydrolysis (DH) and polypeptide content. The optimal hydrolysis process was hydrolysis for 2 h with 0.8 g/100 mL alcalase at 55 °C, pH 7.2 and a substrate concentration of 10 g/100 mL and for another 2 h with 0.4 g/100 mL flavourzyme, resulting in a DH of (13.31± 0.5)% and a polypeptide content of (1.85 ± 0.5) mg/mL.

egg yolk protein；polypeptides；enzymatic hydrolysis；response surface methodology (RSM)

TS201.2

A

1002-6630(2012)01-0147-05

2011-02-13

秦嘉炎(1986—)，女，硕士研究生，主要从事动物性食品加工研究。E-mail：qinjiayan811026@163.com

*通信作者：岳喜庆(1966—)，男，教授，博士，主要从事动物性食品加工研究。E-mail：yxqsyau@126.com