鱿鱼眼透明质酸及其降解产物的抗氧化和保湿作用

代 琼，杨文鸽*，陈小芳，赵月月，熊书利，卢佳芳

(宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

鱿鱼眼透明质酸及其降解产物的抗氧化和保湿作用

代 琼，杨文鸽*，陈小芳，赵月月，熊书利，卢佳芳

(宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

以鱿鱼眼中提取的透明质酸及其降解产物为研究对象，测定不同相对分子质量(Mr)透明质酸的保湿作用以及对Fe3+的还原能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基和羟自由基(·OH)的清除能力。结果表明：透明质酸及其降解产物的保湿性均优于甘油，随着Mr的增加，保湿能力逐渐增强，其中HA-2组分保湿率达到92.66%；不同Mr的透明质酸均有一定的抗氧化作用，其抗氧化活性随着Mr的降低而增大，Mr为6000以下的透明质酸表现出较强的清除自由基能力，而未降解的透明质酸组分HA-1和HA-2的抗氧化能力较弱。

透明质酸；相对分子质量；保湿；自由基；抗氧化作用

自由基是人体内的正常代谢产物，具有很强的生物活性。适量自由基对细胞的生长、分裂、消炎、解毒等起积极作用，但自由基过多或清除过慢可使许多生物大分子及各种细胞受到攻击，从而加速机体的衰老进程，并诱发炎症、免疫失调、恶性肿瘤等多种疾病，其中起作用的主要是质子化的超氧阴离子自由基和羟自由基[1]，因此具有自由基清除作用的抗氧化剂在防治氧自由基诱导的疾病方面具有很多的应用价值。研究表明，大部分从天然产物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基、抑制脂质过氧化等作用[2]，其中广泛存在于动物眼玻璃体、皮肤、脐带、软骨和关节滑液中的透明质酸(HA)对物理、化学以及生物来源的多种自由基具有清除作用，有望成为天然的抗氧化剂[3]。

保湿剂按其来源可分为天然保湿剂和合成保湿剂。目前在化妆品中最常用的是合成保湿剂甘油，其吸湿性能显著、保湿性能一般，作为保湿产品还存在一定不足。从天然物质中提取的具有营养和保湿双重功能的天然保湿剂符合保湿剂的发展趋势，而天然多糖中的透明质酸正是这样一类不可多得的天然保湿材料[3]。

一般认为多糖的生物活性与相对分子质量(Mr)等因素有关[4]，透明质酸也不例外。不同Mr的透明质酸由于作用机制不同，表现出不同的生物活性和生理功能，具有明显的Mr依赖性[3]。鱿鱼是我国重要的海洋捕获物和水产品原料，其加工下脚料鱿鱼眼(约占鱿鱼体质量2%)资源丰富，同时富含高相对分子质量的透明质酸[5]。本实验以鱿鱼加工下脚料鱿鱼眼为原料，从中提取透明质酸并对其进行降解[6]，以对Fe3+的还原能力、对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基及羟自由基(·OH)的清除能力和保湿率进行测定，评价鱿鱼眼透明质酸及其降解产物的抗氧化和保湿活性，探讨透明质酸Mr与其抗氧化和保湿作用之间的关系，以期为不同Mr透明质酸的利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

北太平洋鱿鱼眼睛：来自宁波某鱿鱼加工厂。取完整鱿鱼眼睛，清洗破碎，收集眼眶中的液体备用。

Sephadex G-200凝胶 Amersham Pharmacia Biotech AB公司；双氧水 杭州高晶精细化工有限公司；丙三醇 浙江中星化工试剂有限公司；铁氰化钾 中国上海试剂厂；DPPH 日本和光纯药工业株式会社；三氯化铁 上海展云化工有限公司；水杨酸 天津市博迪化工有限公司。

T6-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；超滤膜组件 天津膜天膜工程技术有限公司；C-BT600-2J蠕动泵 保定兰格恒流泵有限公司；DK-S24水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；BP211D电子分析天平 德国塞多利斯股份有限公司；Delta 320 pH计梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

1.2 不同相对分子质量透明质酸的制备

透明质酸：参考卢佳芳等[5]的方法，由实验室自制。分离纯化得到透明质酸组分HA-1和HA-2，Mr分别为6.77×105、1.73×106。参考王菁等[6]的方法对组分HA-2进行降解。利用超滤膜截留得到6种不同Mr的样品液，Mr分别为6×103以下、6×103～1×104、1×104～2×104、5×104～8×104、8×104～1×105及1×105以上，依次记为样品A、B、C、D、E、F。将样品A、B、C、D、E、F及组分HA-1、HA-2，分别配制成10mg/mL的样品液，备用。

1.3 保湿率的测定[7]

分别配制10mg/mL样品及甘油溶液。分别称取3g溶液于称量皿中，放入硅胶干燥器内，20℃条件下进行保湿实验。每隔1d将称量皿取出称质量，连续称质量6次，由此测定前后试样的质量差。

式中：mn为放置n天后的含水质量；m0为放置前的含水质量。

1.4 对Fe3+的还原能力

采用铁氰化钾法[8]测定。

1.5 对DPPH自由基的清除能力[9]

样品液2mL，加2mL DPPH溶液(乙醇配制)摇匀，静置30min，于517nm波长处测定吸光度。

式中：A1为样品液＋DPPH溶液的吸光度；A2为样品液＋乙醇溶液的吸光度；A0为DPPH溶液＋蒸馏水的吸光度。

1.6 对·OH的清除能力

参照Smironff等[10]方法并改进。取6mmol/L FeSO4溶液2mL，样品液2mL，6mmol/L H2O2溶液2mL，静置10min后加入6mmol/L水杨酸溶液2mL，静置后于波长510nm处比色。空白对照用蒸馏水代替样品液，其余不变。

式中：A0为空白对照的吸光度；A1为某质量浓度样品液的吸光度；A2为无水杨酸时样品液的吸光度。

1.7 数据处理

实验数据平行测定3～5次，结果用平均值±标准差表示。数据用SPSS(11.5)软件进行单因素方差分析，Duncan,s多重比较分析组间差异显著性程度，显著性水平(P＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 透明质酸及其降解产物的保湿性能

保湿作用主要由保湿剂分子对水分子的作用力引起。透明质酸在水溶液中，其分子高度伸展并相互缠绕连接，形成连续的网状结构，而水分子则在此网络内通过极性键和氢键与透明质酸分子结合，使得透明质酸就像“分子海绵”一样，能吸收和保持大量水分。

表1 透明质酸及其降解产物的保湿作用Table 1 Moisture retention capacity of hyaluronic acid and its degradation products

由表1可见，随着Mr的增高，透明质酸的保湿性逐渐增加；随时间的延长，透明质酸及其降解产物的保湿率下降，但是仍大于甘油的保湿率，1d后透明质酸降解产物的保湿率均大于86%，6d后仍维持在35%左右，其中Mr最大的未降解组分HA-2的保湿性最好，1d后保湿率为92.66%，6d后保湿率仍达48.43%，为甘油的1.55倍，说明透明质酸具有良好的保湿性能。方差分析显示，在相同的保湿时间内，降解得到的不同Mr透明质酸样品的保湿性无显著性差异，但降解样品与甘油、未降解样品相比，均存在显著性差异(P＜0.05)。2.2 透明质酸及其降解产物对Fe3+的还原能力

Ueda等[11]研究表明，物质的还原力与其抗氧化性之间存在联系。抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子而清除自由基，还原力越强，抗氧化性越强。抗氧化剂所提供的电子可以使Fe3+还原为Fe2+，从而改变反应体系的颜色，提高波长700nm处的吸光度。

表2 透明质酸及其降解产物对Fe3+的还原能力Table 2 Ferric ion reducing power of hyaluronic acid and its degradation products

由表2可以看出，各Mr的透明质酸均对Fe3+有一定的还原能力，在0.2～1mg/mL质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，透明质酸对Fe3+的还原能力增强。其中未降解的HA-1、HA-2的还原能力最弱，而样品A (Mr6000以下)随着质量浓度增加，吸光度增加明显，还原能力显著高于其他透明质酸样品。方差分析显示对Fe3+的还原能力，HA-1和HA-2之间无显著性差异，但降解后不同Mr的透明质酸之间存在显著性差异。对相同Mr的样品来说，样品质量浓度对其Fe3+的还原能力均具有显著性影响。

2.3 透明质酸及其降解产物对DPPH自由基的清除作用

表3 透明质酸及其降解产物对DPPH自由基的清除能力Table 3 Scavenging capacity of hyaluronic acid and its degradation products against DPPH free radicals

由表3可见，各Mr的透明质酸对DPPH自由基都具有一定的清除能力，其中样品A的清除效果最佳，在2mg/mL时清除率就已达到83.66%，高于其他Mr段10mg/mL时的清除率，而样品B、C和D随着质量浓度增加至6mg/mL清除率趋于平缓，样品E和F随着质量浓度的增加一直呈上升趋势，而未降解的HA-1、HA-2组分对DPPH自由基的清除效果较差，方差分析显示不同Mr的透明质酸对DPPH自由基的清除能力存在显著性差异。

对同一种样品，随着质量浓度的增加，清除率增强，表明透明质酸清除DPPH自由基能力呈明显的量效关系。方差分析显示同一种样品，质量浓度对其清除DPPH自由基能力的影响程度不同，其中样品A无显著性差异；样品B、C、D在质量浓度2～6mg/mL之间呈显著性差异(P＜0.05)，在质量浓度6～10mg/mL之间无显著性差异；样品E、F及HA-1、HA-2在各质量浓度均呈显著性差异。

一般认为物质对DPPH自由基的清除作用与其氢给予能力有关，DPPH自由基能够接受电子或H·形成稳定的反磁性分子[12]。本实验中Mr最小的样品A显示出最强的清除DPPH自由基作用，分子内具有更多接受质子氢的基团，可能是因为和其他样品相比有更强的电子给予能力，这一机理还需要进一步验证。

2.4 透明质酸及其降解产物对·OH的清除作用

表4 透明质酸及其降解产物对·OH的清除能力Table 4 Scavenging capacity of hyaluronic acid and its degradation products against hydroxyl free radicals

由表4可见，样品在2～10mg/mL质量浓度范围内的·OH清除率均有显著增加趋势。但不同Mr样品特点不同，样品A和B对·OH的清除率上升趋势呈S型，样品C、D、E和F随着质量浓度加至6mg/mL趋于稳定，而样品HA-1、HA-2一直呈显著的梯度上升趋势，但清除率最高仅达到50%多，Mr段清除效果较差，但均高于阎欲晓等[13]提取的玉竹多糖对·OH清除率。

在最低质量浓度2mg/mL时样品D对·OH的清除效果最佳，但随着质量浓度的增加，在10mg/mL时样品A对·OH的清除率最高，达到96.06%。方差分析显示HA-1和HA-2对·OH的清除能力无显著性差异，但不同Mr的降解产物之间存在显著性差异。同一种样品，方差分析显示质量浓度对其·OH清除率的影响程度不同，其中样品A、B、F及HA-1、HA-2在各个质量浓度均呈显著性差异；样品C、D、E在质量浓度2～8mg/mL之间呈显著性差异，而在质量浓度8～10mg/mL之间无显著性差异。

王秋霞等[14]研究了石榴籽丙酮提取物抗氧化活性，其中·OH的最高清除率仅达到72.41%，低于透明质酸的最高清除率。Gordon[15]认为还原酮的抗氧化能力是基于其通过给予氢原子从而阻断自由基链的能力而实现的，还原酮还能够与过氧化物的前体反应阻止过氧化物的形成。在质量浓度8～10mg/mL时，低Mr透明质酸的还原能力高于高Mr的透明质酸，可能是低Mr透明质酸由于分子结构松散，氢键作用弱，暴露在外的活性基团相对于结构紧密的高Mr透明质酸要多，因此能够将更多的自由基转变成更稳定的物质，终止自由基的链反应。

3 结 论

对鱿鱼眼透明质酸降解，得到不同Mr的透明质酸，对Mr6×103以下、6×103～1×104、1×104～2× 104、5×104～8×104、8×104～1×105、1×105以上及6.77×105、1.73×106透明质酸的保湿性和抗氧化活性进行研究。结果发现不同Mr透明质酸均具有一定的抗氧化能力，并伴有剂量效应关系，随着样品溶液的质量浓度增加，抗氧化性也随之增强。总体上透明质酸的抗氧化活性随着Mr的降低呈增大趋势；纯化后组分HA-1、HA-2对DPPH自由基的清除率不到20%，抗氧化性较差，而透明质酸的降解产物对Fe3+的还原能力、对DPPH自由基及·OH的清除能力均较好，说明低Mr透明质酸具有较好的抗氧化性，其中Mr6000以下的透明质酸抗氧化效果最好；高Mr的透明质酸具有良好的保湿性。本实验结果对透明质酸的抗氧化、抗衰老保健作用和相关药物、化妆品的开发奠定了基础，但仍需要作进一步的体内验证实验。

[1]方允中, 李文杰. 自由基与酶: 基础理论及其在生物学和医学中的应用[M]. 北京: 科学出版社, 1999: 177-180.

[2]QI Huimin, ZHAO Tingting, ZHANG Quanbin, et al. Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides fromUlva pertusaKjellm (Chlorophyta)[J]. Journal of Applied Phycology, 2005, 17: 527-534.

[3]杨桂兰, 郭学平, 栾贻宏. 不同相对分子质量透明质酸钠的应用[J].食品与药品, 2005, 7(12): 1-3.

[4]方积年, 王顺春. 硫酸酯化多糖的研究进展[J]. 中国药学杂志, 1997 (6): 332-334.

[5]卢佳芳, 杨佳玉, 王菁, 等. 鱿鱼眼透明质酸的酶法提取与分离纯化[J]. 中国食品学报, 2010, 10(4): 88-93.

[6]王菁, 杨佳玉, 金淼, 等. 鱿鱼眼透明质酸降解工艺条件研究[J]. 食品科学, 2009, 30(24): 238-241.

[7]田大听, 冀小雄, 毛海波, 等. 几种天然保湿材料的吸湿和保湿性能研究[J]. 材料导报, 2008, 22(3): 142-143; 147.

[8]JAYAPRAKASHA G K, SINGH R P, SAKARIAH K. Antioxidant activity of grape seed (Vitis vinifera) extracts on peroxidation modelsin vitro[J]. Food Chemistry, 2001, 73: 285-290.

[9]杨文鸽, 谢果凰, 徐大伦, 等. 龙须菜多糖的降解及其降解产物的抗氧化活性[J]. 水产学报, 2009, 33(2): 342-346.

[10]SMIRNOFF N, CUMBES Q J. Hyroxyl radical scavenging activity of compatible solutes[J]. Phytochemistry, 1989, 28: 1057-1060.

[11]UEDA T, SAITO N, SHIMAZU Y, et al. A comparison of scavenging abilities of antioxidants against hydroxyl radicals[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1996, 33: 377-384.

[12]SOARES J R, DINS A P, CUNHA L M, et al. Antioxidant activities of some extracts ofThymus zygis[J]. Free Radical Research, 1997, 26: 469-478.

[13]阎欲晓, 石庆师. 玉竹多糖分离纯化及自由基清除能力研究[J]. 食品工业科技, 2009, 30(2): 149-151.

[14]王秋霞, 许琳, 杨永红. 石榴籽丙酮提取物抗氧化活性研究[J]. 食品研究与开发, 2006, 27(8): 173-176.

[15]GORDON M F. The mechanism of antioxidant actionin vitro[M]// HODSON B J F. Food antioxidants. London: Elsevier, 1990: 11-18.

Antioxidant and Moisture Retention Properties of Hyaluronic Acid and Its Degradation Products from Squid Eyes

DAI Qiong，YANG Wen-ge*，CHEN Xiao-fang，ZHAO Yue-yue，XIONG Shu-li， LU Jia-fang
(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Two hyaluronic acid fractions with different relative molecular mass isolated from squid eyes, named as HA-1 and HA-2, respectively and the degradation products of HA-2 separated by ultrafiltration were determined for their moisture retention capacity and antioxidant properties such as ferric ion reducing power and scavenging activity against DPPH and hydroxyl radicals. The results showed that the moisture retention capacity of hyaluronic acid and its degradation products was superior to that of glycerol and increased with increasing relative molecular mass. Fraction HA-2 exhibited the highest water retention rate, 92.66%. All the HA samples investigated possessed antioxidant activity, which increased with decreasing relative molecular mass. Stronger free radical scavenging activity was observed for hyaluronic acid with relative molecular mass below 6000, while HA-1 and HA-2 had weaker antioxidant activity.

hyaluronic acid；relative molecular mass；moisture retention；radical；antioxidant activity

TS254.9

A

1002-6630(2012)01-0035-04

2011-02-28

农业部“948”项目(2006G-41)；浙江省新苗人才计划项目(2008R40G2070044)；宁波大学SRIP重大课题(2009)

代琼(1989—)，女，本科生，研究方向为海洋生物资源的综合利用。E-mail：daiqiong1803@163.com

*通信作者：杨文鸽(1966—)，女，教授，博士，研究方向为水产品加工与高值化利用。E-mail：yangwenge@nbu.edu.cn