佛手饮料废渣中分离柠檬苦素的研究＊

佛手饮料废渣中分离柠檬苦素的研究＊

柠檬苦素类化合物是一类高度氧化的四环三萜类植物次生代谢产物，有解痉挛与中枢抑制、保护心血管系统、抗过敏和抗炎等作用［3-8］.目前，传统的分离柠檬苦素的方法主要是以柑橘属植物为提取材料，使用大孔树脂吸附法.但传统分离方法用时长，分离效果受树脂吸附作用的影响大［9-10］.而Sephadex LH-20凝胶柱能够简单、快捷、高效率地分离柠檬苦素［11-12］.本实验首次以佛手饮料废渣作为柠檬苦素的提取材料，使用Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离纯化，用核磁共振(NMR)方法进行结构鉴定，并结合高效液相色谱(HPLC)法对柠檬苦素进行了定量测定.

1 材料与方法

1.1 实验材料

佛手饮料残渣：浙江省金华市金佛手农业开发有限公司;柠檬苦素标准品：上海源叶生物科技有限公司;葡聚糖凝胶LH-20(Sephadex LH-20)：通用电气(GE)公司;乙腈(色谱纯);二氯甲烷(色谱纯).其他试剂均为市售分析纯.

色谱仪BioLogic DuFlow Pathfinder 80 System：Bio-Rad公司，美国;AV400傅立叶核磁共振波普仪：bruker公司，美国;DZF-6050B型真空干燥箱：上海一恒科技有限公司;RE-52B旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂;超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司.

1.2 柠檬苦素分离纯化

取150 g佛手饮料废渣，料液比为1∶3，热水回流3 h后过滤，滤液依次用500 mL石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到各萃取部分及水溶液部分.取乙酸乙酯部分浓缩至浸膏，将浸膏真空干燥后得2 g柠檬苦素粗品，再用1.5 mL V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶1的混合溶剂溶解，得棕黄色样品溶液.柠檬苦素分离纯化流程见图1.

1.3 凝胶柱色谱分离

将棕黄色样品溶液经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离纯化.分离条件：检测波长为360 nm;柱体积为112.5 mL，分离柱内径为1.5 cm;流动相为甲醇，流速为0.5 mL/min;进样量为1 mL.采用部分收集器收集，每2 mL为1份，合并第43～59份，干燥得粉末7 mg.

图1 柠檬苦素分离纯化流程

1.4 高效液相色谱测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱为美国AGT Venusil XBP(L)ODS C18柱(250 mm × 4.6 mm，10 μm);流动相为V(乙腈)∶V(水)=45 ∶55 混合溶剂，流速为 0.8 mL/min;柱温为25℃;检测波长为207 nm;进样量为10 μL.测定样品和标准品.

1.4.2 标准曲线的绘制

精确量取2 mg/mL柠檬苦素标准品溶液0.12，0.24，0.48，0.72，0.96 和 1.20 mL 至 6 个10 mL容量瓶中，分别用乙腈定容至刻度，制成一系列浓度梯度标准溶液，经0.45 μm有机滤膜进样，记录色谱图.以峰面积为纵坐标、柠檬苦素标准品的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程：Y=6 ×10－6X(R2=0.999 8).柠檬苦素含量在24～240 μg/mL线性关系良好.

1.4.3 样品中柠檬苦素的定量

将粉末样品用乙腈溶解并定容至50 mL，从中分别量取0.155，0.315，0.625 和 1.250 mL 稀释至10 mL，标记为样品 a，b，c 和 d.其中：c为经HPLC测定样品液中柠檬苦素的质量浓度(μg/mL);V为从50 mL乙腈溶解液中所取样液量(mL);m为佛手饮料废渣的质量(g).

2 结果与讨论

2.1 凝胶柱色谱分离结果

图2 Sephadex LH-20柱色谱分离柠檬苦素

Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离柠檬苦素的出峰时间为225 min，收集该时段的样品.Sephadex LH-20色谱分离结果如图2所示.

2.2 结构鉴定

无色颗粒状结晶(氯仿)，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯，稍溶于甲醇.ESI(+)-MS，m/z：470［M+Na］+.1H NMR(CDCl3，400 MHz)，δ：7.41(1H，m，H-21)，7.27(1H，s，H-23)，6.34(1H，s，H-22)，5.47(1H，s，H-17)，4.77(1H，d，J=13.1 Hz，H-19β)，4.46(1H，d，J=13.1 Hz，H-19α)，4.04(2H，brs，H-1 和 H-15)，2.99(1H，dd，J=16.7，3.5 Hz，H-2β)，2.85(1H，t，J=15.1 Hz，H-6β)，2.68(1H，dd，J=16.7，3.5 Hz，H-2α)，2.46(1H，d，J=13.5 Hz，H-6α)，2.24(1H，d，J=13.3 Hz，H-5)，2.56(1H，d，J=11.2 Hz，H-9)，1.18，1.17，1.07，1.05(各 3H，s).该数据与文献［13］一致，故鉴定此化合物为柠檬苦素(limonin).核磁共振谱图和柠檬苦素结构式见图3.

图31H核磁共振谱图

图4 柠檬苦素的高效液相色谱图

2.3 高效液相色谱测定结果

在色谱条件下，柠檬苦素的分离度高，峰形较好，保留时间为11 min左右，色谱图中其他差异峰是由样品中其他物质引起的.柠檬苦素样品和标准品的色谱图见图4.

2.4 样品中柠檬苦素定量分析结果

根据标准曲线得出的线性回归方程，用高效液相色谱法测定样品中柠檬苦素的峰面积，计算得出柠檬苦素的含量(见表1).

表1 样品中柠檬苦素含量的测定结果

2.5 方法精密度与重现性检测结果

取一定质量浓度的柠檬苦素标准溶液10 μL进样，平行测定5次，以测得的柠檬苦素的峰面积为指标，计算相对标准偏差为0.9%(见表2).取同一批号的样品溶液1份，进样10 μL，以测得的柠檬苦素的峰面积为指标，计算相对标准偏差为1.1%(见表2).该结果表明方法的精密度与重现性均良好.

表2 柠檬苦素测定的精密度与重现性

3 结论

本文对佛手饮料废渣有效成分柠檬苦素的提取进行了研究，建立了Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离、NMR方法进行结构鉴定、高效液相色谱法测定柠檬苦素含量的方法.在此工艺条件下，测得佛手饮料废渣中柠檬苦素含量为1.73 mg/g.综合实验结果可知，该方法分离测定佛手饮料废渣中的柠檬苦素，可行性较强.如何产业化提取柠檬苦素并将提取后的佛手饮料废渣综合再利用，将是今后需重点关注与研究的方向.

［1］中华人民共和国药典编委会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：124.

［2］肖培根.新编中药志：第二卷［M］.北京：化学工业出版社，2002：304.

［3］张卫东，Thi Bang Tam H A，陈万生，等.中药灯盏细辛中酚酸类化合物的结构与活性研究［J］.中国药学杂志，2002，37(8)：579-582.

［4］Miller E G，Gonzales-Sanders A P G，Couvillon A M，et al.Citrus limonoids as inhibitors of oral carcinogenesis［J］.Food Technol，1994，48(11)：110-112.

［5］Lam L K T，Zhang J，Hasegawa S.Citrus limonoid reduction of chemically induced tumorigenesis［J］.Food Technol，1994，48(11)：104-108.

［6］Yu Jun，Wang Linmin，Walzem R L，et al.Antioxidant activity of citrus limonoid，flavonoid，and coumarins［J］.J Agric Food Chem，2005，53(6)：2009-2014.

［7］Sun Chongde，Chen Kunsong，Chen Yang，et al.Contents and antioxidant capacity of limonin and nomilin in different tissues of citrus fruit of four cultivars during fruit growth and maturation［J］.Food Chem，2005，93(4)：599-605.

［8］Govindachari T R，Suresh G，Gopalakrishnan G S，et al.Antifungal activity of some tetranortriterpenoids［J］.Fitoterapia，2000，71(3)：317-320.

［9］崔成久，蒙跃龙，杨钧.大孔树脂分离葛根总黄酮研究［J］.西北药学杂志，1999，14(4)：664-666.

［10］欧来良，史作清，施荣富，等.强性大孔吸附树脂对三七皂苷的分离纯化研究［J］.中草药，2003，34(10)：905-907.

［11］蒋红，邹峥嵘.凝胶柱色谱法分离纯化藜蒿中的黄酮苷类化合物［J］.食品科学，2009，30(22)：101-103.

［12］黄明发，苏学素，焦必宁，等.柑橘多甲氧基黄酮的检测及分离纯化技术研究进展［J］.2009，30(1)：275-281.

［13］周慧，杨卫兵，孙德功.硫酸高铈催化合成异丁酸丁酯［J］.应用化工，2009，38(6)：813-814;822.

许杭琳， 邓 刚， 焦聪聪， 孔黎春， 张艺馨， 黄群晓

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

采用Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离纯化了佛手饮料废渣中的柠檬苦素，分离条件：检测器波长为207 nm;柱体积为112.5 mL，分离柱内径为1.5 cm;流动相为甲醇，流速为0.5 mL/min.用核磁共振法对分离产物进行了结构鉴定.通过高效液相色谱法测定了佛手饮料废渣中柠檬苦素的含量，测定条件：采用美国AGT Venusil XBP(L)ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，10 μm);流动相 V(乙腈)∶V(水)=45 ∶55，流速为 0.8 mL/min;柱温为25℃;检测波长为207 nm.结果显示，佛手饮料废渣中柠檬苦素含量为1.73 mg/g，相对标准偏差为1.1%.

佛手;废渣;柠檬苦素;葡聚糖凝胶LH-20;高效液相色谱

Extraction of limonin from residue of berganot juice

XU Hanglin， DENG Gang， JIAO Congcong， KONG Lichun， ZHANG Yixin， HUANG Qunxiao

(College of Chemistry and Life Science，Zhejiang Normal University，Jinhua Zhejiang 321004，China)

Limonin in waste residue of bergamot was separated by Sephadex LH-20 column chromatography，and the wavelength of detector was set to 207 nm;column volume was 112.5 mL，the diameter of column was 1.5 cm;with methanol as 100%mobile phase and flow rate flow rate was 0.5 mL/min，NMR was used to structural identification after the separation.HPLC was used to determine the quantity of limonin.Chromatographic conditions：American AGT Venusil XBP(L)ODS C18(250 mm ×4.6 mm，10 μm)column with acetonitrile-water，45 ∶55(V/V)as mobile phase and flow rate 0.8 mL/min.The column temperature was controlled at 25℃ and the wavelength of detector was set to 207 nm.The results showed that the RSD was 1.1%and the limonin content in waste residue of bergamot under those conditions reached 1.73 mg/g.

fingered citron;waste residue of bergamot;limonin;Sephadex LH-20;HPLC

TS209

A

2011-12-20

国家自然科学基金资助项目(21006098);浙江师范大学创新科研项目(2010-2013)

许杭琳(1986－)，女，浙江金华人，硕士研究生.研究方向：植物生物技术.

邓 刚.E-mail：denggang@zjnu.cn

1001-5051(2012)03-0322-04

(责任编辑 薛 荣)

佛手(Citrus medica Linn.var.sarcodactylis(Noot))是芸香科柑橘属植物，佛手饮料废渣是佛手饮料生产过程中的主要废弃物，占佛手鲜果质量的80%［1-2］.佛手鲜果的价格昂贵(人民币24～30元/kg)，因此，佛手饮料废渣每年造成的经济浪费和对环境造成的污染不容忽视.然而，目前对佛手饮料废渣的开发利用手段极其有限.本研究发现，佛手饮料废渣中仍含有大量的柠檬苦素类化合物，将其提取出来并加以利用，是提高佛手产业效益的重要途径.