SEC－MALLS法测定羟乙基淀粉130/0.4重均分子量及分子量分布

宋彦会，杜中海，于 鹏，任传杰，袁洪雨

(山东齐都药业有限公司，山东淄博255400)

羟乙基淀粉(Hydroxythyl starch，HES)是玉米支链淀粉经酸水解，然后在碱性条件下经羟乙基化而成，是目前较受关注的一类胶体性血容量扩充剂，主要用于大出血、大面积烧伤、重症监护或手术病人，用以扩充血容量，改善微循环［1，2］。目前临床上常用的是新一代的 HES130/0.4氯化钠注射液［3］。

在有关控制羟乙基淀粉质量的指标中，羟乙基化程度对药物体内保留时间有决定性作用，而羟乙基淀粉的扩容强度主要取决于重均分子量及分子量分布［4］。

目前多用尺寸排阻色谱法(SEC)测定羟乙基淀粉重均分子量及分子量分布，其原理是高聚物溶液流过凝胶柱时分子按体积大小顺序流出，重均分子量(Mw)的对数值与保留时间(TR)呈线性关系。通过测定不同分子量对照品，可得重均分子量(Mw)的对数值与保留时间的线性回归方程lgMw=a+bTR。通过测定待测样品的保留时间，可据此回归方程计算出待测样品的相对重均分子量(Mw)。该方法属于间接测定方法，需使用不同分子量羟乙基淀粉对照品绘制标准曲线，误差较大。

激光光散射法是测定高分子物质重均分子量的直接方法。高分子溶液可视为不均匀介质，当光通过它时，入射光的电磁波诱导高分子成为振荡偶极子，并产生强迫振动作为二次光源发出散射光。高分子溶液的散射光强度远远高于其溶剂，并且强烈依赖于高分子的分子量、链形态、溶液浓度、散射光角度和折光指数增量(dn/dc值)等基本参数，从而得到高分子物质的绝对分子量。当激光光散射仪与分子排阻色谱联用时，分子排阻色谱实现不同分子量高聚物分子的分离，分子按大小顺序依次进入十八角度激光光散射仪确定分子量，绘制出分子量分布图，直接测定出绝对重均分子量及分子量分布，不需要同结构对照品绘制标准曲线，完全不依赖未知样品与标样结构及性质的相似性，能快速、准确地测定物质的重均、数均和Z均分子量及分子量分布［5］。该法操作简便，误差小。

本文对SEC－MALLS法进行了方法学研究，并用此法测定了本公司连续生产三批羟乙基淀粉130/0.4的重均分子量及分子量分布，结果证明该方法简便、准确、重现性好，适用于羟乙基淀粉的重均分子量及分子量分布检测。

1 仪器和试药

1.1 仪器 Wyatt DAWN HELEOS－Ⅱ十八角度激光光散射仪(美国怀雅特公司);Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);BS110S电子天平(d=0.1 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.2 试药 中分子量羟乙基淀粉对照品(欧洲药典委员会，Code:Y0001277，Mw:130 100);纯化水，羟乙基淀粉 130/0.4(山东齐都药业有限公司，批号:110601、110602、110603)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:预柱TSKgel Guard column pwxl(4 cm×6 mm)，分离柱 TSKgel G4000 pwxl(30 cm ×7.8 mm)2根串联;检测器:十八角度激光光散射检测器和示差折光检测器在相同温度联用;流动相:取醋酸钠18.7 g，加叠氮钠1.72 g，加水4 000 mL 溶解，加冰乙酸34.5 mL，加水至5 000 mL;流速:0.5 mL·min－1;柱温:35 ℃;进样体积:50 μL;流动相折光指数:1.334;dn/dc:0.135 mL·g－1;二次维里系数A2:10－4mol·mL·g－1。

2.2 测定法 照如下方法测定。本品重均分子量应为110 000～150 000，10%大分子重均分子量不得大于380 000，10%小分子重均分子量不得小于15 000。

测定法:取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1 mL中约含20 mg的溶液，摇匀，经 0.2 μm 过滤，取 50 μL 续滤液注入液相色谱仪，记录结果，计算，即得。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 取中分子量羟乙基淀粉适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL约含20 mg的溶液，摇匀，经 0.2 μm 过滤，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL约含20 mg的溶液，摇匀，经0.2 μm过滤，即得。

2.4 SEC－MALLS方法学考察

2.4.1 专属性考察 精密量取对照品溶液、供试品溶液(批号:110601)及流动相各50 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明流动相对供试品无干扰，该方法专属性强，测定结果见图 1、2。

图1 空白溶剂

图2 羟乙基淀粉130/0.4(批号:110601)供试品

2.4.2 准确度试验 取中分子量羟乙基淀粉对照品适量，加流动相溶解并分别稀释制成每1 mL中约含16 mg、20 mg、24 mg的溶液，每个浓度各分别制备3份溶液，摇匀，经0.2 μm过滤，精密量取50 μL续滤液，注入液相色谱仪，记录色谱图，测得中分子量羟乙基淀粉对照品重均分子量(Mw)平均值为130 078，RSD为0.14%，平均值与标称值之差为22，相对误差为0.02%，小于5%，可见，该方法准确度高，测定结果见表1。

表1 准确度试验

2.4.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号:110601)，室温放置0、12、24、36 h后分别注入液相色谱仪，记录色谱图，结果表明本品在36 h内稳定性好，测定结果见表2。

2.4.4 重复性试验 取本品(批号:110601)适量，加流动相溶解并分别稀释制成每1 mL中约含16 mg、20 mg、24 mg的溶液，每个浓度各分别制备3份溶液，摇匀，经0.2 μm过滤，精密量取50 μL续滤液，注入液相色谱仪，记录色谱图，RSD为0.15%，表明该方法重复性好，测定结果见表3。

表2 溶液稳定性试验

表3 重复性试验

2.5 重均分子量及分子量分布的测定 取供试品溶液(批号:110601、110602、110603)，注入液相色谱仪，记录色谱图，三批供试品重均分子量均在110 000～150 000，10%大分子部分重均分子量均小于380 000，10%小分子部分重均分子量均大于15 000，测定结果见表4。

3 讨论

通过上述方法学验证，结果表明该方法准确度高、重现性好，完全不依赖未知样品与标样结构及性质的相似性，能快速、准确地测定物质的重均、数均和Z均分子量及分子量分布，适合羟乙基淀粉130/0.4重均分子量及分子量分布检测。

表4 羟乙基淀粉200/0.5重均分子量及分子量分布测定结果

［1］Maier S，Holz － Holzl C，Pajk W，et al.Microcirculatory parameters after isotonic and hypertonic colloidal fluid resuscitation in acute hemorrhagic shock［J］.J Trauma，2009，66(2):337 －345.

［2］Osthaus WA，Huber D，Baumker C，et al.Plasma volume replacement with HES 130/0.42 obviates negative side effects of pneumoperitoneum in piglets［J］.Paediatr Anaesth，2008，18(10):922 －928.

［3］Gallandat Huet RC，Siemons AW，Baus D，et al.A novel hydroxyethyl starch(Voluven)for effective perioperative plasma volume substitution in cardiac surgery［J］.Can J Anaesth，2000，47(12):1207 －1215.

［4］罗逸，刘菊蓉，郭兴蓬，等.合成产物羟乙基淀粉主要质控指标研究［J］.药物分析杂志，2004，24(3):296－298.

［5］左榘.激光散射原理及在高分子科学中的应用［M］.郑州:河南科学技术出版社，1994:48，229.