HPLC法测定氟尿嘧啶有关物质的方法研究

徐 飞，闫玉梅，虞 炜

(南通精华制药股份有限公司，山东南通226006)

氟尿嘧啶为抗代谢抗肿瘤药物，对结肠癌、胃癌、卵巢癌有较好的效果，对肾、子宫癌、子宫颈癌和绒毛膜上皮癌有治疗前途，动脉滴注可以治疗头颈癌。在现行欧洲、美国、日本和中国等很多药典中均有收载该品种，且都用到HPLC方法的测试，本文根据欧洲药典对氟尿嘧啶有关物质测试的HPLC方法，研究确定其对氟尿嘧啶强迫降解后的杂质测试，从而确定该方法对氟尿嘧啶有关物质测试的有效性，取得了满意效果。

1 仪器与试药

Waters 515－2487－717高效液相色谱仪，Empower色谱软件。氟尿嘧啶杂质A(巴比妥酸)、氟尿嘧啶杂质B(5－羟基尿嘧啶)、氟尿嘧啶杂质C(尿嘧啶)、氟尿嘧啶杂质D(5－甲氧基尿嘧啶)、氟尿嘧啶杂质E(5－氯尿嘧啶)均为本公司购买的对照品，磷酸二氢钾为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Wakosil－Ⅱ5 C18(4.6 mm×150 mm，5 μm);流速:1.0 mL·min－1;检测波长:266 nm;柱温:室温;进样量:20 μL;流动相:用5 mol·L－1氢氧化钾溶液将6.805 g·L－1磷酸二氢钾溶液的 pH 调至5.7 ±0.1。测定过程避光操作。

2.2 样品和对照品溶液的制备 供试品溶液:取被测物50.0 mg，加流动相溶解并稀释至50.0 mL。精密量取该溶液5.0 mL，用流动相稀释至 50.0 mL。

对照品溶液(a):取氟尿嘧啶杂质C对照品5.0mg，用流动相溶解稀释到50.0 mL。对照品溶液(b):精密量取对照品溶液(a)1.0 mL，用流动相稀释到100 mL。精密量取该溶液1.0 mL，用流动相稀释到10.0 mL。对照品溶液(c):取氟尿嘧啶杂质A对照品5.0 mg，用流动相溶解稀释到50.0 mL。精密量取该溶液1.0 mL，用流动相稀释到100.0 mL。然后再精密量取这个稀释溶液1.0 mL，用流动相稀释到10.0 mL。对照品溶液(d):取氟尿嘧啶杂质B对照品5.0 mg，用流动相溶解稀释到50.0 mL。精密量取该溶液1.0 mL，用流动相稀释到100.0 mL。然后再精密量取这个稀释溶液1.0 mL，用流动相稀释到10.0 mL。对照品溶液(e):取供试品溶液1.0 mL，用流动相稀释到100.0 mL。精密量取该溶液1.0 mL，用流动相稀释到10.0 mL。对照品溶液(f):将1.0 mL测试液加入到1.0 mL对照液(a)中，用流动相稀释到10.0 mL。对照品溶液(g)取氟尿嘧啶杂质混合物(含杂质D、E)的对照品一瓶，溶解于1.0 mL的流动相中。

图1 杂质a图

图2 杂质b图

图3 杂质c图

图4 杂质c和5－FU图

图5 杂质d和e图

依次进对照液(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)和供试液，各杂质相对于5－氟尿嘧啶主峰的相对保留时间:杂质A约为0.5，杂质 B 约为0.7，杂质 C 约为 0.9，杂质 D 约为 1.6，杂质 E 约为 1.9。校正因子:杂质 D=1.5，杂质 E=1.3。

2.3 酸碱破坏降解 酸破坏:称取1.0 g氟尿嘧啶样品于100 mL 0.1 mol·L－1盐酸溶液中，加热回流 8 h 后，放冷，取降解液进样20 μL检测杂质，碱破坏:称取1.0 g氟尿嘧啶样品于100 mL 0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液中，加热回流8 h，放冷，取降解液进样20 μL检测杂质;另取酸、碱降解液稀释到一定浓度进行含量测试。结果显示氟尿嘧啶在酸中有一定的降解，新增两个0.1%左右的未知杂质，其余杂质无明显变化，在碱中有明显降解，含量有明显降低，增加一个0.5%左右的杂质，降解后杂质都能检测出，且通过PDA检测器对主峰和杂质峰进行峰纯度检查，结果表明降解杂质及主峰均无其他未检查到的杂峰包裹。

2.4 高温破坏降解 将一定的供试品置称量瓶摊成≤5 mm厚的薄层，开口于100℃温度下放置5 d，然后将样品配制成一定浓度进行杂质和含量测试，结果表明高温5 d后样品含量下降约2.5%，新增另2个约0.01%的未知杂质，原有杂质无变化。

2.5 高温高湿破坏降解 将一定量的供试品放容量瓶中开口置80℃ 75%温湿度条件下，放置12 d，然后进行杂质和含量测试，结果表明在此条件放置12 d后降解出3个未知杂质，原有杂质无变化，含量降低了2%。

2.6 光照破坏降解 将一定量的供试品开口放置在照度为(4 500±500)Lx的光照装置内10 d，然后将样品配制成一定浓度进行杂质和含量测试，结果显示杂质A和B均发生降解不存在了，杂质D无明显变化，总杂质略微降低，含量无明显变化。

2.7 氧化破坏降解 将一定量的供试品置1% ～3%浓度的过氧化氢30℃温度放置24 h后，然后吸取一定量稀释后进行杂质和含量测试，结果表明杂质A发生降解不存在了，杂质B、D无明显变化，有一个未知杂质出现，总杂质无明显变化，含量下降约2%。

2.8 各杂质的检出限和定量限 将3倍左右于基线噪声峰高的浓度确定为检出限，10倍左右于基线噪声峰高的浓度确定为定量限，配制各杂质合适的浓度进行测试，杂质A(巴比妥酸)的检出限为 1 ng·mL－1、定量限为 1.5 ng·mL－1，氟尿嘧啶杂质B(5－羟基尿嘧啶)的检出限为10 ng·mL－1、定量限为20 ng·mL－1，氟尿嘧啶杂质C(尿嘧啶)的检出限为10 ng·mL－1、定量限为 30 ng·mL－1，氟尿嘧啶杂质 D(5 －甲氧基尿嘧啶)的检出限为8 ng·mL－1、定量限为20 ng·mL－1，氟尿嘧啶杂质E(5－氯尿嘧啶)的检出限为10 ng·mL－1、定量限为 20 ng·mL－1，氟尿嘧啶的检出限为 0.25 ng·mL－1、定量限为 5 ng·mL－1。

3 讨论

在选定的色谱条件下，将氟尿嘧啶样品进行酸、碱、高温、高温高湿、光照、氧化等破坏降解后进行测试，结果表明氟尿嘧啶在这几个条件下具有不同程度的降解，都能将杂质进行很好的分离，且通过PDA检测器进行峰纯度测试表明没有峰包裹的情况，都能完全检查各峰。所以该色谱方法对于氟尿嘧啶的有关物质检测有效可行，能有效检测出样品中的各降解物质。