西洋菜中叶绿素提取工艺研究

魏强华，冼翠芝，张薇珠，杨淑娟，潘丽华

（广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州 510300）

西洋菜中叶绿素提取工艺研究

魏强华，冼翠芝，张薇珠，杨淑娟，潘丽华

（广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东广州 510300）

采用分光光度法测定了西洋菜的叶、茎中叶绿素含量，结合西洋菜的叶/茎质量比，解决了西洋菜整体研究时取样不均的问题。对西洋菜中叶绿素提取工艺进行了研究，确定了最佳提取工艺为：室温下、提取3次、每次提取时间40min、液固比5∶1。本研究表明超声波处理会降低提取的叶绿素含量，但不会引起波长扫描图谱形状的改变。

西洋菜，叶绿素，超声波，正交实验法

西洋菜又名水菜、豆瓣菜等，引进我国已有100多年的历史，在广东、广西等省栽培较多，一般作为蔬菜直接食用，口感嫩脆，深受人们喜爱。西洋菜适宜的生长温度为15～25℃，立春之后栽培的西洋菜由于温度高，品质变差，口感老粗，不受人们喜爱，除部分被作为饲料外，大多数被抛弃于田埂，有待开发[1]。西洋菜色泽深绿，富含叶绿素，是较好的叶绿素来源。有关西洋菜中叶绿素提取的研究尚未见报道。本研究测定了西洋菜中叶、茎的叶绿素含量，采用乙醇提取法提取叶绿素，确定了优化的提取工艺，并初步探讨了超声波对于西洋菜中叶绿素提取工艺的影响，以期为西洋菜中叶绿素资源的开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

西洋菜 购于学校附近的农贸市场；无水乙醇分析纯。

S22PC型可见分光光度计 上海棱光技术有限公司；UV-2450型紫外可见分光光度计 日本岛津公司；JJ500型精密电子天平 常熟双杰测试仪器厂；DK-S26型电热恒温水浴锅 上海森信实验仪器有限公司；HS6150型超声波清洗仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 西洋菜中叶绿素提取工艺 选取新鲜、无变黄的西洋菜，用蒸馏水冲洗干净，沥干，分别收集叶、茎。将叶、茎剪碎放到研钵中，小心研磨至变成泥状。根据实验需要，分别称取0.8g叶、4g茎、4g叶茎混合物（叶∶茎=1∶3，m/m）样品于小烧杯中。加入无水乙醇，研磨均匀后放到暗处静置提取，之后过滤到50mL或100mL容量瓶中，进行1～3次提取、过滤，用无水乙醇定容、摇匀，取样进行叶绿素含量测定。

1.2.2 叶绿素提取的单因素实验研究

1.2.2.1 不同提取溶剂对叶绿素提取效果的影响 选用乙酸乙酯、无水乙醇、石油醚、丙酮4种溶剂作为提取溶剂，称取4g西洋菜样品4份，分别加30mL提取溶剂，研磨均匀后放到暗处静置提取，提取时间为30min，提取2次。过滤，收集滤液，测定叶绿素含量。

1.2.2.2 不同提取温度对叶绿素提取效果的影响 称取4g西洋菜样品5份，分别加入30mL无水乙醇，分别在室温、30、40、50、60℃条件下提取30min，提取次数为2次。过滤，收集滤液，测定叶绿素含量。

1.2.2.3 不同提取时间对叶绿素提取效果的影响 称取4g西洋菜样品5份，各加入30mL无水乙醇，分别在室温条件下提取10、20、30、40、50min，提取次数为2次。过滤，收集滤液，测定叶绿素含量。

1.2.2.4 不同液固比对叶绿素提取效果的影响 称取4g西洋菜样品5份，按液固比2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1加入无水乙醇，分别在室温条件下提取30min，提取次数为2次。过滤，收集滤液，测定叶绿素含量。

1.2.2.5 不同提取次数对叶绿素提取效果的影响 称取4g西洋菜样品，按液固比4∶1加入无水乙醇，在室温条件下提取30min。过滤，收集滤液，为第1次提取液，测定其叶绿素含量。取滤渣再次进行第2次、第3次提取，测定其提取液中叶绿素含量。

1.2.3 叶绿素提取的正交实验研究 西洋菜中叶绿素提取工艺主要有三个影响因素，包括提取次数、提取时间、液固比。在单因素实验的基础上，采用L9（34）正交实验进行研究，因素水平见表1。

将西洋菜洗净沥干，叶茎分离，按叶∶茎=1∶3（质量比）的比例取样，用剪刀剪碎放到研钵中，研磨至泥状，待用。称取若干份样品，每份样品各4g。按表1的实验安排处理样品，过滤到50mL或100mL容量瓶中，用无水乙醇定容。再分别从提取液中移取2mL样液到10mL容量瓶中，用无水乙醇稀释、定容。测吸光度值，计算提取的叶绿素含量。

表1 正交实验的因素与水平Table 1 Factors and levels in orthogonal experiments

1.2.4 超声波辅助提取叶绿素研究 将西洋菜洗净沥干，叶茎分离，按叶∶茎=1∶3（质量比）的比例取样，用剪刀剪碎放到研钵中，研磨至泥状，待用。称取若干份样品于小烧杯中，每份4g。各加20mL无水乙醇，放入超声波清洗仪里进行超声波处理，超声波处理时间分别为0、10、20min。之后按照正交实验的优化工艺进行叶绿素提取，收集到100mL容量瓶中，定容。移取2mL样液到10mL容量瓶中，用无水乙醇定容。测吸光度值，计算提取的叶绿素含量。

1.2.5 西洋菜中叶绿素含量测定 采用分光光度法测定西洋菜中叶绿素含量[2]。

移取2mL的样品提取液至10mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀。将样品稀释液用1cm比色皿分别在波长645nm和663nm处测吸光度值。通过下述计算公式，计算出叶绿素含量，也就是每克样品中提取出的叶绿素含量，用以表示提取效果。一般提取的叶绿素含量越高，表示提取效果越好。

式中：A645—样品稀释液在波长645nm时的吸光度；A663—样品稀释液在波长663nm时的吸光度；n—稀释倍数；V—样品溶液体积，mL；m—样品质量，g。

2 结果与讨论

2.1 西洋菜不同部位的叶绿素含量测定

在研究中发现，每根西洋菜上的叶、茎质量比是不同的，相差较大。若直接取少量西洋菜进行叶绿素提取研究，由于叶、茎比例不同，容易导致取样不均，因此有必要检测西洋菜中叶、茎的平均质量比。取100g左右西洋菜，分别称取其叶、茎质量，可知西洋菜中叶的质量为25%～30%，西洋菜的叶、茎平均质量比近似为1∶3。因此，在后续西洋菜取样时，都按照1∶3的质量比称取叶、茎，使得样品具有代表性，也保证了叶绿素测定数据稳定。西洋菜中叶、茎绿色深浅差别大，反映西洋菜中叶、茎所含叶绿素含量相差较大，结果见表2。

表2 西洋菜中叶、茎的叶绿素含量Table 2 Chlorophyll content of leaf and caudex from watercress

由表2可见，西洋菜中叶、茎的叶绿素含量差别很大，西洋菜的叶片的叶绿素含量达到1.5426mg/g，远高于西洋菜的茎的叶绿素含量（0.1174mg/g）。在西洋菜用于蔬菜汁饮料或提取叶绿素研究中，若选取西洋菜整体（叶、茎整体）进行研究，特别是取样量较少时，则必须考虑叶、茎的叶绿素含量以及叶、茎质量比的差异。本研究采用先确定西洋菜的叶、茎质量比，再按比例称取叶、茎，用以代表西洋菜整体，可以较好地解决取样不均的问题。

2.2 不同提取溶剂对叶绿素提取效果的影响

表3 不同提取溶剂对叶绿素提取效果的影响Table 3 Effect of extraction solvent on the chlorophyll content

叶绿素为脂溶性色素，一般采用有机溶剂进行提取。由表3可见，丙酮的提取效果最好，其次是无水乙醇、乙酸乙酯，最差的是石油醚。从结果可知，丙酮和无水乙醇的提取效果都较好，丙酮的提取效果略高于无水乙醇的，但是相对于丙酮而言，无水乙醇价格便宜、毒性低。综合经济效益、安全的考虑，本研究选用无水乙醇作为提取溶剂。

2.3 不同提取温度对叶绿素提取效果的影响

表4 不同提取温度对叶绿素提取效果的影响Table 4 Effect of extraction temperature on the chlorophyll content

由表4可知，在室温（25℃）下，所提取的叶绿素含量是最高的，可以达到0.4955mg/g。在室温到30℃范围内，提取的叶绿素含量基本保持不变。之后随着提取温度升高，提取的叶绿素含量逐渐降低，50℃时达到最低点，60℃时略有上升。这说明叶绿素本身不稳定，容易在较高温度下，产生结构改变而发生破坏。有文献提出采用较高的提取温度提取叶绿素[3]，以加速叶绿素扩散速度，提高提取效率；其实叶绿素不稳定，不宜采用提高提取温度的方法。因此，本研究提取温度采用室温。

2.4 不同提取时间对叶绿素提取效果的影响

由图1可见，在10～30min以内随着提取时间的延长，西洋菜中叶绿素提取量逐渐增加，30min时达到最大值，之后叶绿素提取量开始略微降低，这可能是由于叶绿素不稳定而部分分解有关。因此在叶绿素提取中，提取时间不宜过长，且应注意避光，以减少叶绿素破坏。

图1 不同提取时间对叶绿素提取效果的影响Fig.1 Effect of extraction time on the chlorophyll content

2.5 不同液固比对叶绿素提取效果的影响由图2可见，随着液固比增加，叶绿素提取量增加，达到4∶1时，叶绿素提取量稳定下来。本研究采用乙醇作为提取溶剂，需要通过液固比来控制乙醇用量。叶绿素提取工艺中，主要目的是用尽可能少的乙醇用量达到尽可能大的叶绿素提取效果。此外，液固比过大，还会造成后续浓缩蒸馏费用的增加。因此，

图2 不同液固比对叶绿素提取效果的影响Fig.2 Effect of ratio of liquid to material on the chlorophyll content

确定液固比在3∶1～5∶1比较适宜。

2.6 不同提取次数对叶绿素提取效果的影响

图3 不同提取次数对叶绿素提取效果的影响Fig.3 Effect of extraction times on the chlorophyll content

由图3可见，随着提取次数的增加叶绿素提取量增加，但增加幅度逐渐减少。同时也观察到提取3次后，滤渣色泽明显变浅，说明其中叶绿素提取较完全。为了较充分提取出西洋菜中的叶绿素，提取次数应采用2～3次。

2.7 叶绿素提取的正交实验研究

由表5可知，在西洋菜中叶绿素提取实验中，第7号实验的叶绿素提取率最高，可达0.5723mg/g，其组合为A3B1C3，即提取次数为3次，每次提取时间为20min，液固比为5∶1。对叶绿素含量结果进行极差分析，由极差（R）可知，影响因素的主次为：提取次数＞液固比＞提取时间，其中最大的影响因素是提取次数。

表5 西洋菜中叶绿素提取的正交实验结果Table 5 The orthogonal experiments results of the extrating process of chlorophyll from watercress

根据表5的各个因素的k值，确定最优组合为：A3B3C3，即提取次数3次、每次提取时间40min、液固比5∶1。按照该优化工艺对西洋菜进行叶绿素提取研究，其提取的叶绿素含量达到0.6013mg/g，结果高于表5中的第7号实验结果。通过该优化工艺提取叶绿素后的样品残渣色泽为黄色，基本上没有绿色，说明西洋菜中的叶绿素提取较为完全。考虑到本研究为小试研究，主要目的是摸索西洋菜中叶绿素提取规律，确定提取工艺，故暂根据叶绿素含量最高的组合来选取最优组合，今后进行中试研究时再考虑经济因素等进行优化。

2.8 超声波辅助提取叶绿素的研究

超声波辅助提取叶绿素已有相关文献报道，可以提高提取效率，缩短提取时间[3]，但西洋菜中叶绿素提取研究未见报道。本实验采用超声波辅助处理后，再按最优提取工艺进行提取，初步探讨超声波辅助提取西洋菜叶绿素的可行性。

表6 超声波处理对叶绿素含量的影响Table 6 Effect of treatment of ultrasonic waves on the chlorophyll content

由表6可知，在本实验2.7部分的最优提取工艺基础上，增加超声波处理10、20min后，相关样品提取的叶绿素含量都比不进行超声波处理的降低，而有的文献报道超声波提取可以显著提高叶绿素提取率、缩短提取时间[4]。分析其原因可能是：a.超声波处理过程中，样品、溶剂量少，超声波能量使得提取温度升高，而叶绿素对热不稳定，本实验的2.3部分已经证实提取温度高会破坏西洋菜中的叶绿素，使得提取的叶绿素含量降低。b.本实验采用超声波辅助处理后，再按本实验2.7部分的最优提取工艺进行提取，而最优提取工艺进行提取西洋菜叶绿素较为完全，使得超声波辅助提取在本实验中效果不明显。

图4 对样品进行不同超声波处理后的吸收光谱图Fig.4 Absorption spectra of samples in different treatments of ultrasonic waves

对样品使用紫外可见分光光度计进行波长扫描（波长500～800nm），结果见图4。通过图谱可知，超声波处理10、20min的样品与未超声波处理样品相比，图谱形状非常类似，出峰位置都一样，没有偏移；都在663nm处有最大吸收峰值，这也是叶绿素的特征吸收峰[5-6]；未超声波处理样品在663nm处峰值更高。由此可知，超声波处理前后样品的叶绿素结构没有改变，而仅仅是叶绿素的含量发生了改变。

3 结论

西洋菜的叶、茎的叶绿素含量差别较大。通过测定西洋菜的叶、茎中叶绿素含量，按照西洋菜的叶、茎的平均质量比取样，可以较好地解决西洋菜整体研究时取样不均的问题。本研究对西洋菜中叶绿素提取工艺进行了初步探索，确定了最佳提取工艺为：室温下、提取3次、每次提取时间40min、液固比5∶1。在实验中，发现超声波处理会降低提取的叶绿素含量，需要改变超声波辅助提取方法，有待进一步研究。

[1]杨乾展，赵浩如，程景才，等.西洋菜的研究进展[J].河北农业科学，2008，12（4）：22-24.

[2]李婷婷，舒红英，徐军.苦瓜叶绿素的提取和稳定性的研究[J].江西化工，2008（3）：65-68.

[3]陈小全，田坤新，邵辉莹，等.菠菜叶绿素的提取及叶绿素铜钠盐的制备[J].泰山医学院学报，2010，31（4）：259-261.

[4]王爽，姚秉华.超声法提取松针叶绿素及稳定性研究[J].纺织高校基础科学学报，2010，23（1）：87-90.

[5]潘慧娟.不同溶剂对蚕沙中叶绿素提取效果的影响[J].杭州师范学院学报：自然科学版，2006，5（1）：50-52.

[6]张鸿发，励建荣，童军华.从海带中提取叶绿素的研究[J].武汉工业学院学报，2000（3）：9-11.

Study on extracting process of chlorophyll from watercress

WEI Qiang-hua，XIAN Cui-zhi，ZHANG Wei-zhu，YANG SHU-juan，PAN LI-hua
（Department of Food Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，China）

The chlorophyll content of leaf and caudex from watercress was measured by spectrophotometer method.And weight ratio of leaf to caudex from watercress was measured in order to sample uniformly.The extracting process of chlorophyll from watercress was studied.The optimal conditions were as follows：extracting temperature was room temperature，extracting 3 times，extracting period was 40minutes，and the ratio of alcohol to watercress sample was 5∶1.The chlorophyll content of samples was decreased while the scanning spectrum did not changed by the treatment of ultrasonic waves.

watercress；chlorophyll；ultrasonic waves；orthogonal experiments

TS255.36

B

1002-0306（2012）11-0275-04

2011－08－30

魏强华（1978－），男，硕士，讲师，研究方向：食品资源开发与利用。