川麦冬提取物制备及其在卷烟中的应用

李 斌，陈小明，林 凯，张 峰，洪祖灿，庄吴勇，蓝洪桥

（福建中烟工业有限责任公司，福建厦门 361022）

川麦冬提取物制备及其在卷烟中的应用

李 斌，陈小明，林 凯，张 峰，洪祖灿，庄吴勇，蓝洪桥*

（福建中烟工业有限责任公司，福建厦门 361022）

为开发新型烟用天然植物提取物，对川麦冬皂苷类成分开展提取分离实验。正交实验结果表明，其最佳提取分离条件为10倍量30%乙醇提取，浓缩后经5倍量HPD-100型大孔吸附树脂吸附，3BV水洗脱后以3BV 30%乙醇洗脱；高效液相色谱法分析其皂苷元主要组成为假叶树皂苷元、薯蓣皂苷元、亚莫皂苷元；将川麦冬皂苷添加进某牌号卷烟，经感官评吸表明，该提取物具有明显生津感、使烟气圆润、降低刺激性和增加余味舒适柔和的作用。

川麦冬，皂苷，提取，大孔树脂柱分离，卷烟

川麦冬为百合科植物沿阶草属多年生常绿草本植物麦冬Ophiopogon japonicus（Thumb.）Ker-Gawll的干燥块根，主产于四川绵阳，主要成分为甾体皂苷、多糖、黄酮等[1-3]。川麦冬性甘，微寒，具有养阴生津、润肺清心功能，常用于肺燥干咳、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴等症状[4]。目前，国内对川麦冬研究多数在种植、加工和成分分析等方面[5-7]，对其提取应用报道较少[8]，而在卷烟中的应用研究尚未见报道。为开发新型天然烟用香料资源，采用溶剂提取法，设计正交实验对川麦冬皂苷的提取工艺进行了研究[9]，提取物经大孔树脂分离技术得到川麦冬皂苷，用高效液相色谱-蒸发光散射法分析其皂苷元组成，并对川麦冬皂苷在卷烟中的作用进行评价，以期为川麦冬进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

95%乙醇 山东酒精总厂；水 自制MilliQ纯水；乙睛、甲醇 色谱纯，国药集团化学试剂有限公司；大孔吸附树脂 HPD-100，沧州宝恩；川麦冬 厦门市燕来福制药有限公司，产地四川；麦冬皂苷D、假叶树皂苷元、薯蓣皂苷元、亚莫皂苷元等标准品 Sigma公司。

高效液相色谱仪 Prominence LC-80，日本岛津；PL-ELSD蒸发光散射检测器 英国PL公司；C18柱大连依利特，200mm×4.6mm；填料 SinoChrom ODSBP，5μm；旋转蒸发仪 EYELA，N-1001；水浴锅EYELA，SB-200；真空泵 EYELA PFR-1000；分析天平 METTLEKTOLEDDAL104；粉碎机 WK-600A，青州市精诚机械。

1.2 实验方法

1.2.1 川麦冬提取物的制备

1.2.1.1 提取方法 川麦冬，45℃烘干，粉碎，过20目筛网。称取50g样品分别用5倍量水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇浸润后回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，减压浓缩得到川麦冬粗提液。

1.2.1.2 分离条件 川麦冬粗提液经HPD-100型大孔树脂柱吸附，以影响HPD-100型大孔吸附树脂分离效果的主要因素树脂/药材比、洗脱醇浓度、洗脱体积作为参考因素，每个因素拟定3个水平，见表1，实验以麦冬皂D含量为考察指标。

表1 大孔树脂分离效果的因素水平表Table 1L9（34）of the macroporous resin separation

1.2.1.3 麦冬皂苷D含量HPLC分析 色谱柱：SinoChrom ODS-BP C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈∶水（35∶65，v/v）；检测器：PL-ELSD蒸发光散射检测器（英国PL公司）；气化温度 65℃；气体流速（N2）2.6L/min。

1.2.2 主要皂苷元组成分析

1.2.2.1 提取物前处理方法 用浓度为4mol/L三氟乙酸4mL溶解30mg麦冬提取物，加热至100℃，密闭冷凝，水解6h后取出。冷却至室温后，加2mol/L的NaOH使得样品溶液pH至中性。以等体积CHCl3萃取水解液3次，合并CHCl3萃取层，减压回收至干，以少量甲醇溶解，HPLC-ELSD法检测皂苷元[10-11]。

2.2.2 大小比数 大小比数被定义为胸径大于参照树的相邻木占n株最近相邻木的株数比例，用以描述林木个体大小分化程度，或树种的生长优势程度(描述非均一性)，其表达式 式中：Ui为参照树i的大小比数；n为最近相邻木的株数；kij为离散性变量，其值定义为，当参照树i比相邻木j大时，kij=0，否则kij=1。大小比数量化了参照树与其相邻木的关系，其值Ui越低，说明比参照树大的相邻木越少式中：U为树种或林分平均大小比数；N为树种或林分的林木总株数。

1.2.2.2 HPLC-ELSD分析 色谱柱：SinoChrom ODSBP C18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流动相：乙腈∶水（43∶57，v/v）；检测器：PL-ELSD蒸发光散射检测器（英国PL公司）：气化温度 45℃；气体流速（N2）2.6L/min。

1.2.3 实验卷烟样品制备 将不同条件制得的川麦冬提取物，用60%乙醇配制成10%溶液，按照烟丝重量0.5%的施加比例通过喷洒均匀施加到烟丝中，置于（22±1）℃和相对湿度60%±2%环境中平衡48h后卷制成烟支，由评吸委员会评委对加香效果进行评价。

2 结果与分析

2.1 提取条件确定

将施加水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇川麦冬粗提物的样品卷烟进行感官评价，结果表明，30%乙醇粗提物在柔和烟气和降低刺激等方面效果最好，因此选用30%乙醇作为提取溶剂；但感官评价结果也表明，30%乙醇提取物存在麦冬气息较重等问题，因此需对粗提物进一步分离。

2.2 麦冬皂苷D测定条件的确定

2.2.1 标准曲线 精密称取麦冬皂苷D对照品，以甲醇配成0.90，0.71，0.30，0.20，0.15mg/mL的标准溶液，以HPLC-ELSD测定峰面积。以峰面积与进样质量（μg）作回归分析，得回归方程为：M=202528A－26235，r=0.9928（其中，M为峰面积，A为进样质量，μg）。

2.2.2 精密度实验 精密吸取对照品溶液20μL，重复进样5次，按上述色谱条件测定峰面积，结果RSD为1.46%。

2.2.4 回收率实验 在已知含量的麦冬药材中加入一定量的麦冬皂苷D对照品，按含量测定项下方法制备样品，用上述色谱条件测定峰面积，计算回收率，结果表明，平均回收率为96.3%，RSD=2.6%（n=5）。

2.3 30%乙醇提取物大孔树脂洗脱工艺的确定

取川麦冬30%乙醇提取物9份，均以3BV水洗后洗脱，以麦冬皂苷D含量为考察指标。

表2 大孔树脂分离效果的正交实验及其结果表Table 2 Orthogonal experiment results of the macroporous resin separation

2.4 方差分析

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

由表2、表3正交实验极差R分析及方差分析可知，影响大孔树脂分离效果的诸因素的主次关系依次是洗脱体积、树脂/药材比、洗脱醇度。麦冬皂苷D洗脱工艺的最佳组合为A1B2C3，即树脂/药材比为5，30%的洗脱醇度及洗脱3BV。利用该工艺可以使川麦冬的有效组分达到最佳提取，以麦冬皂苷D为代表性成分，其含量可达0.37%。

2.5 主要皂苷元组成定性分析

图1 麦冬皂苷元标准品混合HPLC色谱图Fig.1 HPLC spectrum of the standard mixed saponins

图2 30%乙醇洗脱提取物水解后HPLC色谱图Fig.2 HPLC spectrum of the hydrolyed extract of 30%ethanol fraction

由于川麦冬多糖含量高，30%乙醇提取物经大孔树脂吸附水洗后，10%乙醇洗脱部分仍以多糖为主；30%乙醇洗脱部分主要以皂苷为主；60%乙醇洗脱部分包含小分子皂苷、黄酮苷及高极性黄酮类成分。川麦冬主要皂苷元和30%乙醇提取，30%乙醇洗脱部分经酸水解后用CHCl3萃取，萃取物经HPLC-ELSD分析，其色谱图（图1、图2）比较可知，总提取物中含有四种川麦冬常见的皂苷元，而30%乙醇提取，30%乙醇洗脱部分水解物中假叶树皂苷元（A1）及亚莫皂苷元（A2）含量较高，薯蓣皂苷元（A3）亦有观察到，未观察到含有鲁斯考皂苷元（A4），在10～17.5min部分尚有部分未鉴定成分，说明30%洗脱部分川麦冬提取物中的皂苷元主要由假叶树皂苷元、薯蓣皂苷元、亚莫皂苷元组成。

2.6 卷烟样品感官评价

在中、低档卷烟的加香实验中，感官评价结果显示：10%乙醇洗脱部分杂气较重，口感略差，而60%乙醇洗脱部分刺激较大，协调性较差；30%乙醇提取，30%乙醇洗脱部分麦冬提取物外来药草气息较轻，但与烟香较为协调，能使烟气柔和细腻，提高烟气的圆润性，降低刺激性和干燥感，增加余味的回甜和生津感，效果最佳。

3 结论

经正交实验确定，由10倍量30%乙醇提取、浓缩后经5倍量HPD-100型大孔吸附树脂吸附，经3BV水洗脱后，用3BV的30%乙醇洗脱，所得到的洗脱物含量最高。感官评价结果表明，川麦冬提取物30%乙醇洗脱部分能明显改善中、低档卷烟的吸味品质，使烟气柔和细腻，提高烟气的圆润性，降低刺激性和干燥感，增加余味的回甜和生津感。

[1]王建忠，陈小兵，王风鹏.川麦冬皂苷类化学成分研究[J].有机化学，2008，28（9）：1620-1623.

[2]赵飞，程方叙，张兴国，等.直立型川麦冬多糖含量变化规律的初步研究[J].安徽农业科学，2008，36（33）：14591-14592.

[3]GUO Xing，CHENG Fang-xu，LIAO Zheng，et al.Preliminary research of the regular pattern between flavonoids content and the age of erect type ophiopogon jaonicus[J].Agricultural Science&Technology，2008，9（5）：142-144.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：化学工业出版社，2005：106-107.

[5]匙丰，程方叙，张兴国，等.直立型川麦冬生物学性状与块根产量相关性研究[J].安徽农业科学，2010，38（3）：1240-1241.

[6]刘江.四川盆地麦冬种质资源的综合评价研究[D].成都：四川农业大学，2010.

[7]曹原湘.川麦冬良种特性及质量标准的初步研究[D].成都：西南交通大学，2010.

[8]王晓君，王维香.川麦冬多糖的微波提取[J].食品工业科技，2007，28（4）：128-132.

[9]许文凤，王文君，徐明生，等.雪松松针总三萜皂苷提取工艺的研究[J].食品工业科技，2011，32（6）：312-314.

[10]赵飞，张兴国，程方叙.麦冬多糖的单糖组成及结构修饰研究[J].安徽农业科学，2009，37（27）：13099-13100.

[11]吴弢，余伯阳，程志红，等.HPLC-ELSD法测定湖北麦冬中主要皂苷的含量[J].中草药，2000，32（3）：175-177.

Preparation of the Ophiopogon japonicus（Thumb.） Ker-Gawll extracts and its application in cigarette

LI Bin，CHEN Xiao-ming，LIN Kai，ZHANG Feng，HONG Zu-can，ZHUANG Wu-yong，LAN Hong-qiao*（China Tobacco Fujian Industrial Co.，Ltd.，Xiamen 361022，China）

In order to develop new tobacco extracts from natural plants，the extract from Ophiopogon japonicus（Thumb.） Ker-Gawll was prepared.Orthogonal experiments results indicated that the optimum condition of isolation and preparation was extracting for 10 times with 30%ethanol，5 times with macroporous resin and washing with 3BV water and 3BV 30%ethanol successively by using column separation.The major saponin constituents were analyzed as ruscogenin，diosgenin，yamogenin by HPLC.The evaluation of the reference cigarette using these extracts showed that the sample can stimulate saliva，enhance the moisture of the smoke，reduce irritation and make the aftertaste pleasant and soft.

Ophiopogon japonicus（Thumb.） Ker-Gawll；saponin；extraction；macroporous resin column separation；cigarette

TS41

B

1002-0306（2012）11-0250-03

2011－12－23 * 通讯联系人

李斌（1969-），男，工程师，主要从事卷烟配方和香精香料研究。

福建中烟工业有限责任公司卷烟增香保润重大专项资助项FJZYHT200804）。