响应面优化花生分离蛋白提取工艺的研究

章 宝，单 杨，2，*，李高阳，2

（1.中南大学隆平分院，湖南长沙 410125；2.湖南省农产品加工研究所，湖南长沙 410125）

响应面优化花生分离蛋白提取工艺的研究

章 宝1，单 杨1，2，*，李高阳1，2

（1.中南大学隆平分院，湖南长沙 410125；2.湖南省农产品加工研究所，湖南长沙 410125）

采用碱提酸沉法从低变性花生粕中提取花生分离蛋白，以花生分离蛋白提取率为响应值，应用Box-Behnken Design（BBD）对碱提温度、时间、pH和液料比4因素进行响应面分析，确定碱提的最佳工艺条件为：碱提温度57.5℃、时间100min、pH9.2和液料比12∶1；通过单因素实验确定最佳酸沉pH为4.5。在此条件下，花生分离蛋白最高提取率为87.57%，与预测值87.88%相对误差约为0.4%。

碱提酸沉，响应面法，分离蛋白，氨基酸

花生除直接食用外，主要用于榨油。我国每年可产生125万t的花生饼粕[1]，花生饼粕含蛋白质50%左右，其中10%为清蛋白，90%为碱性蛋白，花生蛋白生物价（BV）为58，蛋白质效率比值（PER）为1.7，比面粉和玉米高[2-3]。在植物蛋白资源中，花生蛋白居第三位，占蛋白总量的11%，是较理想的食用蛋白资源[4]。与大豆蛋白相比，具有含肠胃胀气因子和抗营养因子较少的优点[5]；与菜籽、棉籽蛋白相比，具有所含毒性物质较少的优点。影响花生分离蛋白提取率的因素很多，如提取温度、时间、pH、液料比等。花生分离蛋白提取工艺的优化，多数采用正交实验方法，鲜有见到响应面法在这方面的研究报道。响应面法是一种优化反应条件和加工工艺参数的有效方法，广泛应用于化学化工、生物工程和食品工业等方面[6]。与正交实验设计相比，响应面具有实验周期短，回归方程精度高，能同时研究几种因素交互作用等优点。目前，高纯度花生蛋白的制备技术并不成熟，极大地限制了花生蛋白的应用范围。作为一种经典分离蛋白质的方法，碱提酸沉法可以用于高纯度花生蛋白的制取[7]。本文对碱提酸沉法制备花生分离蛋白的条件进行了优化研究，以期获得更高的得率，提高操作稳定性，为工业化生产提供有效技术参数。

1 材料与方法

1.1材料与设备

花生粕 实验室超临界CO2制备，低变性脱脂花生粕粉碎后过100目筛，总蛋白54.88%、灰分3.83%、脂肪2.06%、水分5.53%；氢氧化钠、盐酸 北京金辉通业化工有限公司，分析纯。

Foss Kjeltec 2300全自动凯氏定氮仪 福斯中国有限公司；电子天平 FA1104型，上海燕恒实业有限公司；JJ-150W电子恒速搅拌器 上海比朗仪器有限公司；HJ9025型pH计 上海器宏科学仪器设备有限公司；水浴锅 XMT-DA数显调节仪，余姚市亚显仪器仪表有限公司；DS-1高速组织捣碎机 江苏金城国胜实验仪器厂；TGL-20M台式高速离心机 上海恒科有限公司；日立L-8900全自动氨基酸分析仪 江苏同生科技有限公司；PH-1500小型高速喷雾干燥器 上海高机生物工程有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花生分离蛋白提取工艺流程

1.2.2 检测方法 蛋白质：GB 5009.5-2010；水分：GB 5009.3-2010；脂肪：GB/T 5512-2008；灰分：GB 5009.4-2010；氨基酸分析[8]：采用日立L-8900全自动氨基酸分析仪进行测定分析。

1.2.3 单因素实验 对影响花生分离蛋白提取率的液料比、碱提温度、碱提时间和pH 4个因素进行单因素实验，并确定各因素响应面实验取值范围。提取率按下式计算：

1.2.4 响应面实验设计 根据单因素实验结果，采用Box-Behnken 4因素3水平的响应面（RSM），以碱提温度、时间、液料比和pH为实验因素（自变量），以花生分离蛋白的提取率为评价指标（响应值），分别进行二次多项回归方程拟合及优化分析。实验设计因素及水平见表1。

表1 响应面实验设计因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experimental design factors

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 碱提时间对花生分离蛋白提取率的影响 在碱提pH9.0，液料比为10∶1，碱提温度50℃，碱提2次的条件下，考察不同浸提时间（0.5、1、1.5、2、2.5h）对花生分离蛋白提取率的影响，结果见图1。

由图1可知，在碱提时间小于1.5h时，分离蛋白提取率随着碱提时间的增加而增加，当时间大于1.5h时，分离蛋白的提取率随着时间的延长无明显变化。即时间达到1.5h时，蛋白的溶出率已达到动态平衡。因此，从节省时间和能耗的角度考虑，选择1.5h为最佳碱提时间。

图1 碱提时间对花生分离蛋白提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on peanut protein isolate yield

2.1.2 碱提pH对花生分离蛋白提取率的影响 在液料比为10∶1，碱提温度50℃，碱提2次，每次1.5h的条件下，考察不同碱提pH（7.5，8.0，8.5，9.0，9.5）对花生分离蛋白提取率的影响，结果见图2。

由图2可以看出，碱提pH对分离蛋白提取率有很大影响，pH小于8时，花生分离蛋白的提取率的增加缓慢，pH在8～9时，随着pH的增加，分离蛋白提取率增加迅速，当pH大于9时，花生分离蛋白的提取率变化不明显，并且随着pH的升高提取液粘度增加，不利于下一步的离心分离过程；另外，加入过多的碱会使花生分离蛋白口感带有咸苦味，从而限制花生分离蛋白的进一步利用[9]。而且碱性太强还会引起脱氨、脱羧和肽键断裂，引起胱赖反应，将氨基酸转变为有毒化合物[10]。故初步确定碱提pH为9.0。

图2 碱提pH对花生分离蛋白提取率的影响Fig.2 Effect of extraction pH on peanut protein isolate yield

2.1.3 碱提温度对花生分离蛋白提取率的影响 在液料比为10∶1，碱提pH9.0，碱提2次，每次1.5h的条件下，考察不同碱提温度（30、40、50、60、70℃）对花生分离蛋白提取率的影响，结果见图3。

图3 碱提温度对花生分离蛋白提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on peanut protein isolate yield

由图3可以看出，当温度小于60℃时，随着温度的升高，分离蛋白的提取率随之增加，但当温度大于60℃后，蛋白的提取率反而下降。主要原因是温度高于65℃时蛋白质开始变性，温度高于80℃时，蛋白质会形成凝胶，所以碱提温度过高，不仅会使蛋白变性，影响其功能性，而且粘度增加，分离困难，分离能耗提高[11]。初步确定碱提温度为60℃。

2.1.4 液料比对花生分离蛋白提取率的影响 在碱提pH9.0，碱提温度50℃，碱提2次，每次1.5h的条件下，考察不同液料比（5∶1，10∶1，15∶1，20∶1）对花生分离蛋白提取率的影响，结果见图4。

图4 液料比对花生分离蛋白提取率的影响Fig.4 Effect of ratio of liquid and material on peanut protein isolate yield

由图4可知，液料比小于10∶1时，随液料比的增加，分离蛋白的提取率有所增加，但当液料比大于10∶1后，分离蛋白的提取率随液料比的增加无明显变化。当液料比达到10∶1时，蛋白的溶出率已达到动态平衡，初步确定液料比为10∶1。

2.2 响应面实验结果与分析

对以上4个单因素使用Design-Expert 8.0.1软件设计4因素3水平共29个实验（5个中心点）响应面分析实验。这29个实验分为两类：其中24个析因点为自变量取值在各因素所构成三位顶点，零点为区域中心点，重复5次，用于估计实验误差。

2.2.1 实验结果 响应面实验结果见表2。

2.2.2 模型建立及显著性检验 对表2实验数据进行多元回归拟合，得到花生蛋白提取率（Y）对碱提温度（X1）、碱提时间（X2）、液料比（X3）和碱提pH（X4）二次多项回归模型为：

对该模型进行显著性检验，结果见表3。

由表3可知，模型P＜0.0001，说明该模型高度显著，失拟项P=0.0535＞0.05，说明该模型失拟项不显著，复相关系数R2=0.9913，Radj2=0.9827，说明该方程对实验拟合好，实验误差小；信噪比Adeq Precision=33.949＞4，说明该模型可得到足够强相应信号，因此可以用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。由表4可看出，模型一次项X2、X3、X4高度显著，X1显著；交互项X1X2高度显著，X1X4、X2X3影响显著，其他交互项不显著；二次项X12、X22、X32、X42影响也高度显著。表明各影响因素对花生分离蛋白提取率的影响不是简单的线性关系。通过直接比较方程中一次项系数绝对值的大小来判断因素影响的主次性，对花生分离蛋白提取率影响因素由大到小依次是：X3＞X4＞X2＞X1，即液料比＞pH＞时间＞温度。

表2 Box-Behnken模型实验设计方案及实验结果Table 2 Box-Behnken experimental design and model test results

表3 回归模型方差分析结果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

2.2.3 提取工艺的响应面分析与优化 响应面的图形是响应值对各实验因素的值所构成的一个三维空间在二维平面上的等高图[12]。响应面曲线较陡，表明影响因子的影响较为显著，响应值变化较大；曲线较为平滑，表明影响因子的影响较小，响应值变化较小。由图5可看出，X1、X2交互作用高度显著，X1、X4和X2、X3交互作用显著，其他交互项不显著。根据响应面分析得到的最佳工艺参数：碱提温度57.41℃，时间1.67h，液料比12.14∶1，pH9.22。在此条件下，花生分离蛋白的提取率的理论预测值为87.88%。

考虑到实际操作的局限性，故将实际提取工艺条件修正为碱提温度57.5℃、时间100min、液料比12∶1、pH9.2，在修正条件下进行3次重复验证实验，分离蛋白的提取率平均值达到87.57%，与理论值相对误差约为0.4%。此条件下制备的花生分离蛋白的纯度为94.58%。由此可见，响应面分析的优化结果与实际值较吻合，且能获得高纯度花生分离蛋白，得到的提取工艺条件具有一定的应用价值。

表4 回归模型系数显著性检验结果Table 4 Regression coefficient significance test results

图5 各两因素交互作用对提取率影响的响应面图Fig.5 Response surfaces plot showing the effects of temperature and time，temperature and ratio of liquid and material，temperature and pH，time and ratio of liquid and material，time and pH，and ratio of liquid and material and pH on extraction yield of peanut protein isolate

2.3 酸沉pH条件的确定

分别称取5份10.0g花生粕，在碱提条件为温度50℃、液料比10∶1、时间1.5h、pH9进行碱提，得到的碱提液于不同的pH（4.1，4.3，4.5，4.7，4.9）条件进行酸沉，测得分离蛋白的得率，重复实验三次，结果见图6。

由图6可看出，花生分离蛋白提取率随pH的升高，先增加后减少，在pH4.5时，分离蛋白的提取率达最大值，初步判定花生分离蛋白的等电点为pH4.5，故选择pH4.5为最佳酸沉pH。

图6 酸沉pH对花生分离蛋白提取率的影响Fig.6 Effect of acid precipitation pH on peanut protein isolate yield

2.4 低变性花生粕和花生分离蛋白的氨基酸含量比较

由表5可知，花生分离蛋白中共检测到17种氨基酸，氨基酸总含量为93.63g/100g，而低变性花生粕的氨基酸含量仅为54.60%。花生分离蛋白中成人必需的7种氨基酸（色氨酸未测出）含量达24.99g/100g，占氨基酸总量的26.69%。花生分离蛋白中的17种氨基酸含量都超过了1g/100g，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量较高，均超过了10g/100g。花生分离蛋白必需氨基酸含量与FAO模式相比赖氨酸和蛋氨酸含量较低，而其他氨基酸成分含量较平衡。

3 结论

对花生分离蛋白碱提工艺条件进行了单因素和响应面优化实验。结果显示液料比、pH及时间对花生分离蛋白提取率的影响极显著，温度的影响显著，影响作用按主次顺序排列为液料比＞pH＞时间＞温度。确定最佳碱提温度57.5℃，碱提2次，每次100min，碱提液料比为12∶1，碱提pH9.2。并对酸沉pH进行了单因素实验，得到最佳酸沉pH为4.5。在此工艺条件下，制得花生分离蛋白产品得率最高可达87.57%。制备的花生分离蛋白的氨基酸种类及含量非常丰富，所含的17种氨基酸含量均超过1g/100g，其中谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸的含量较高，都超过了10g/100g，将其添加到其他谷物中，起到氨基酸互补作用，对开发营养保健品有着重要作用。

表5 花生蛋白氨基酸组成含量（g/100g）Table 5 Amino acid composition of peanut protein content

制备的花生分离蛋白的纯度为94.58%，采用喷雾干燥可提高花生分离蛋白的组织状态，进而改善其乳化性、持水性等相关的特性，使其能广泛应用于肉制品、乳制品、焙烤食品及保健食品等。响应面优化得到的花生分离蛋白提取工艺条件对实际生产具有重要的参考价值。

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Optimization of processing parameters for extraction of peanut protein isolate by response surface methodology

ZHANG Bao1，SHAN Yang1，2，*，LI Gao-yang1，2
（1.Longping Branch Graduate School，Central South University，Changsha 410125，China；2.Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China）

Peanut protein isolate was prepared through alkaline extraction and acid precipitation from low variability peanut meal.The optimal values of theoretical parameters including extraction temperature，ratio of liquid and material，extraction time and extraction pH were investigated by Box-Behnken surface response design method.The optimum conditions of alkaline extraction were as followed：extraction temperature 57.5℃，ratio of liquid to material 12 ∶1，extraction time 100min and pH 9.2.And based on the single-factor test，the optimum pH4.5 of acid precipitation was determined.Under these conditions，the maximum protein extraction rate of 87.57%was obtained.The relative error with predicted value was 0.4%.

alkali extraction and acid precipitation；response surface methodology；protein isolate；amino acid

TS201.1

B

1002-0306（2012）11-0270-05

2011－09－29 * 通讯联系人

章宝（1986-），男，在读研究生，研究方向：食品加工与综合利用。

公益性行业（农业）科研专项（200903043）；湖南省产学研结合专项（2009XK6001）。