微生物分离玉米皮水解液中L－阿拉伯糖的研究

邹鸿菲，张泽生，*，郑 敏

(1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学，天津 300457; 2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

微生物分离玉米皮水解液中L－阿拉伯糖的研究

邹鸿菲1，2，+，张泽生1，2，+，*，郑 敏1，2

(1.食品营养与安全省部共建教育部重点实验室，天津科技大学，天津 300457; 2.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

比较几株酵母菌和霉菌对玉米皮水解液中L－阿拉伯糖的分离情况，从中选出能够快速利用葡萄糖和木糖，难以利用L－阿拉伯糖的菌株。选用5株酵母菌，7株霉菌和自环境中分离筛选出的2株霉菌经模拟培养基发酵后筛选出5株菌进行对玉米皮水解液的发酵。结果表明，球拟酵母发酵4d，绿木霉、灰霉和自环境中分离筛选出的霉菌Mgb1、Mgb2发酵3d后，玉米皮水解液中木糖的保留率均小于5%，L－阿拉伯糖的保留率可达75%以上。分离方法简单有效，所用的3种菌株常见易得，为微生物法分离L－阿拉伯糖提供了一定的参考。

玉米皮水解液，L－阿拉伯糖，球拟酵母，绿木霉，灰霉

L－阿拉伯糖(L－Arabinose)是一种戊醛糖，在自然界中主要以阿拉伯聚糖、阿拉伯糖基木聚糖、阿拉伯糖基半乳糖体及类似于高等植物半纤维的形式存在［1］，它最具代表性的作用是能够选择性地抑制分解蔗糖的蔗糖酶，从而减少蔗糖的吸收和新脂肪的生成［2－3］，如果在日常食用的蔗糖中添加3%的L－阿拉伯糖可以抑制约60%的蔗糖吸收。作为玉米淀粉加工副产物的玉米皮中半纤维素的含量可高达38% (以干物质计)［4］，其中绝大部分为阿拉伯木聚糖，且价格低廉，广泛易得，是提取L－阿拉伯糖的优良原料。在L－阿拉伯糖的分离方面，用树脂或薄层色谱板进行分离操作复杂且收效小，提取到的L－阿拉伯糖产率低，工业化难度大［5］。使用微生物法分离L－阿拉伯糖具有选择性高，反应条件温和，副产物少，无污染等优点，因此具有很大的应用潜力与广阔的发展前景［6］。本工作拟利用一些常见的酵母菌和霉菌菌种，考察其对玉米皮水解液中3种主要单糖葡萄糖、木糖和L－阿拉伯糖的利用情况，选出具有选择性利用木糖的菌株，为今后微生物法分离L－阿拉伯糖的工业化生产提供有效易得的菌株材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

玉米皮 河北德瑞淀粉有限公司;葡萄糖标准品、木糖标准品、L－阿拉伯糖标准品 色谱纯，Sigma公司;鲁式酵母(Saccharomycesrouxii)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青岛酵母、球拟酵母(Torulopsis)，绿 木 霉 (Trichodermaspp)、腐 霉(Pythium)、灰霉 (Botrytiscinerea)、交链孢霉(Alternaria)、黑 曲 霉 (Aspergillusniger)、青 霉(Penicillium)、镰刀霉(Fusarium) 天津科技大学食品工程与生物技术学院菌种保藏中心;毕赤酵母(Pichiapastoris) 天津科技大学生物工程学院菌种保藏中心;酵母菌种子培养基(YEPD) 酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然;霉菌种子培养基(PDA) 马铃薯200g，切块煮沸30m in后取滤液，葡萄糖20g，补水至1000m L，pH自然;酵母菌模拟培养基 酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖10g/L，L－阿拉伯糖6.67g/L，葡萄糖3.33g/L，pH自然;霉菌模拟培养基 马铃薯200g，切块煮沸30m in后取滤液，木糖10g，L－阿拉伯糖6.67g，葡萄糖3g，补水至1000m L，pH自然;木糖基本培养基 木糖20g/L，(NH4)2SO45g/L，KH2PO41g/L，Mg2SO4·7H2O 0.5g/L，琼脂2g/L，pH6.0;玉米皮水解液培养基 玉米皮酸水解液中加入0.5%(NH4)2SO4，0.1%KH2PO4，0.05%Mg2SO4·7H2O，pH调至各菌所需值。

CTO－20A高效液相色谱仪、RID－10A示差折光检测器、SCR－101C色谱柱 日本岛津。

1.2 实验方法

1.2.1 玉米皮水解液的制备 玉米皮粉碎后过60目筛，烘干待用。称取30g玉米皮粉碎物置于500m L圆底烧瓶内，加入300m L 3%H2SO4水溶液搅匀，90℃下浸提2.5h。过滤后向酸水解液中加入CaCO3粉末中和至各菌种适宜发酵的pH［7］，将中和产生的CaSO4固体过滤除去，得玉米皮酸水解液。

1.2.2 常见菌种的筛选 菌株经斜面活化后，转接至3m L模拟培养基中活化。酵母30℃，霉菌28℃，150 r/m in摇床培养24h后，以10%(V/V)的接种量接入到装有30m L模拟培养基的250m L三角瓶中，150 r/m in摇床发酵培养，各菌种发酵培养温度同其活化培养温度。每隔24h取样，采用高效液相色谱法检测发酵液中各单糖含量。

1.2.3 从环境中筛选菌种 取天津科技大学校园内银杏树嫩叶1g，剪碎后加入到10m L无菌水内，振荡片刻。无菌操作，取1m L振荡液，加入装有9m L无菌水的试管中，振荡均匀后，吸取100μL木糖基本培养基平板上进行涂布，倒置于28℃培养箱内培养。48h后挑取平板内形状规则、直径较大的霉菌单菌落进行分离纯化，得到两株霉菌，命名为 Mgb1和Mgb2。经斜面和模拟培养基活化后以10%的接种量接入到装有30m L模拟培养基的250m L三角瓶中，28℃ 150 r/m in摇床发酵培养。每隔24h取样，采用高效液相色谱法检测发酵液中各单糖含量。

1.2.4 玉米皮酸水解液的发酵 选定的几株菌经活化培养后以10%的接种量接入到装有30m L玉米皮水解液培养基的250m L三角瓶中，150 r/m in摇床发酵培养。每隔24h取样，采用高效液相色谱法检测发酵液中各单糖含量。

1.2.5 单糖含量测定 高效液相色谱法(HPLC)。色谱条件:色谱柱:岛津shim－pack SCR－101C;流动相:三重蒸馏水;柱温:80℃;流速:0.8m L/m in。

2 结果与分析

2.1 玉米皮水解液的测定

将制备的玉米皮酸水解液用高效液相色谱法进行成分分析。水解液中单糖液相色谱图见图1，图1中葡萄糖、木糖和L－阿拉伯糖的保留时间分别为8.49、9.33和10.58min，其含量分别为6.1%、18.8%、11.3%(以玉米皮干物质计)。

图1 水解液中各组分单糖的HPLC图Fig.1 HPLC ofmonosaccharides in hydrolyzate

2.2 常见菌种筛选结果

依据玉米皮酸水解液中各单糖组分的含量设计模拟培养基，即葡萄糖∶木糖∶L－阿拉伯糖的含量比值接近1∶3∶2。按照1.2.5的方法比较5种酵母、7种霉菌发酵过程中对三种单糖的利用情况。挑选出能快速大量利用木糖但基本不利用L－阿拉伯糖的菌株，用于之后对玉米皮酸水解液的发酵。

2.2.1 酵母菌筛选结果 实验结果表明，5种酵母在发酵1d之后基本能将葡萄糖完全利用，其消耗木糖情况见图2，消耗L－阿拉伯糖见图3。

图2 酵母菌发酵液木糖含量对比Fig.2 Comparation of xylose content in yeast fermentation broth

由图2可知，青岛酵母和酿酒酵母基本不利用木糖，鲁式酵母对木糖的消耗速率较慢，发酵6d之后木糖只消耗了约50%。毕赤酵母能够在发酵6d后基本将木糖消耗完全，球拟酵母在发酵3d后基本将木糖消耗完全，发酵4d后已检测不到木糖的残留。

由图3可知，在发酵的前3d球拟酵母消耗阿拉伯糖的速率较慢，含量比毕赤酵母发酵同期内阿拉伯糖的含量多，发酵3d后球拟酵母对阿拉伯糖的利用速率明显加快，这是由于发酵液中的木糖在发酵3d后已基本没有剩余，阿拉伯糖是发酵后期唯一可以利用的丰富碳源。

酵母菌筛选实验表明，球拟酵母在发酵时对木糖的选择性利用效果较好。发酵3d之后阿拉伯糖的浓度由6.67mg/m L降至5.56mg/m L，保留率为83.4%，木糖则由10mg/m L降至0.58mg/m L，保留率仅为5.8%。

图3 酵母菌发酵液阿拉伯糖含量对比Fig.3 Comparation of L－arabinose contentin yeast fermentation broth

2.2.2 霉菌筛选结果 实验结果表明，7种霉菌在发酵2d之后基本能将葡萄糖完全利用，其消耗木糖情况见图4，消耗L－阿拉伯糖见图5。

图4 霉菌发酵液木糖含量对比Fig.4 Comparation of xylose content inmold fermentation broth

由图4可知，7种霉菌均可利用木糖，绿木霉和镰刀霉发酵3d后，灰霉和黑曲霉发酵4d后，交链孢霉发酵5d后，青霉发酵6d后木糖基本被完全消耗，而腐霉消耗木糖的速率相对较慢。

图5 霉菌发酵液阿拉伯糖含量对比Fig.5 Comparation of L－arabinose content in mold fermentation broth

由图4、图5可知，绿木霉发酵3d之后木糖浓度由10mg/m L降至0.2mg/m L，保留率为2%，阿拉伯糖的浓度由6.67mg/m L降至4.67mg/m L，保留率为70%。灰霉发酵3d后阿拉伯糖的浓度由6.67mg/m L降至5.12mg/mL，保留率为76.8%，木糖则由10mg/m L降至0.52mg/m L，保留率为5.2%。

2.3 菌种筛选结果

根据一般菌种筛选材料的选取范围，选取植被土壤、树皮和嫩叶进行实验，发现从银杏叶中分离纯化的两株霉菌可以在木糖培养基平板上生长，且生长状态良好，原因可能是植物嫩叶部分生长旺盛，新陈代谢速度快，从而更易分离出快速分解木糖的菌株。

由银杏叶中分离纯化出的两株霉菌，活化后接入模拟培养基培养，每隔24h取样，测定结果见图6、图7。

图6 Mgb1对培养基中各单糖利用情况Fig.6 Utilization ofmonosaccharides inmedium by Mgb1

图7 Mgb2对培养基中各单糖利用情况Fig.7 Utilization ofmonosaccharides inmedium by Mgb2

由图6、图7可知，分离纯化出的的两株霉菌对木糖和L－阿拉伯糖的选择利用性较好。在发酵3d之后葡萄糖被完全消耗掉，Mgb1发酵液中木糖浓度由10mg/m L降至0.45mg/m L，保留率4.5%，阿拉伯糖的浓度由6.67mg/m L降至5.91mg/m L，保留率为88.6%。Mgb2发酵液中木糖浓度由10mg/m L降至0.39mg/m L，保留率为 3.9%，阿拉伯糖的浓度由6.67mg/m L降至5.18mg/m L，保留率为77.7%。

2.4 玉米皮水解发酵

按照1.2.4的方法，将球拟酵母、绿木霉、灰霉、Mgb1和Mgb2分别接入至玉米皮水解液培养基中发酵。结果见表1。

由表1可知，球拟酵母在发酵4d后，绿木霉、灰霉、Mgb1和Mgb2在发酵3d以后木糖的保留率均小于5%，而L－阿拉伯糖的保留率可达75%以上。与在模拟培养基中相比，球拟酵母的发酵周期略有延长，原因是玉米皮水解液中会产生乙酸、糠醛等毒性物质抑制菌体生长［8］。

3 结论

目前工业上生产L－阿拉伯糖大多使用酸解半纤维素的方法，产物为多种单糖混合物。本实验针对目前树脂或薄层色谱板分离L－阿拉伯糖操作复杂且收效小的缺点，利用单糖能够作为微生物生长碳源的生理特点分离L－阿拉伯糖。通过对常见的5种酵母菌，7种霉菌和两株自环境中分离筛选的霉菌进行玉米皮水解液的发酵，发现球拟酵母发酵4d，绿木霉、灰霉和自环境中分离筛选出的霉菌Mgb1、Mgb2发酵3d后，玉米皮水解液中木糖的保留率均小于5%，L－阿拉伯糖的保留率可达75%以上，霉菌的发酵时间短于酵母菌。

研究选出了球拟酵母、绿木霉、灰霉这3种常见的微生物，对木糖和L－阿拉伯糖具有较好的选择性利用，为今后L－阿拉伯糖的工业化生产提供参考，为其并提供了一种自然环境中筛选菌株的方法。

表1 5种菌株发酵玉米皮水解液结果Table 1 Results of fermentation by five strains in hydrolyzate

［1］秦海敏，俞宗沅，容如滨.L－阿拉伯糖研究进展［J］.化工与生物工程，2006，23(2):50－52.

［2］Serik，Sanaik，Matsuon，etal.L－arabinose selectively inhibits intestinal sucrose in an uncompetitive manner and suppresses glycemic response after sucrose ingestion in animals［J］. Metabolism，1996，45(11):1368－1374.

［3］Hizukuri s.Nutritional and physiological functions and uses of L－Arabinose［J］.JAppl Glycosci，1999，46:159－165.

［4］尤新.玉米深加工技术［M］.第2版.北京:中国轻工业出版社，2008:242－243.

［5］方永亮，郑珩，余江河.功能性甜味剂L－阿拉伯糖的研究进展［J］.氨基酸和生物资源，2009，31(1):8－12.

［6］唐晓丹，张伟，林炳昌.L－阿拉伯糖的制备及应用研究进展［J］.安徽农业科学，2009，37(10):4643－4644，4646

［7］李道义，闫巧娟，江正强，等.酵母菌发酵玉米皮酸水解制备结晶 L－阿拉伯糖的研究［J］.食品科学，2007，28(4): 125－128.

［8］Pessoa a，Mancilha i，Sato S.Cultivation of Candida tropicalis in sugar cane hemicellulosic hydrolysate for microbial protein production［J］.Journal of Biotechnology，1996，51:83－88.

Study on separation performance of L－arabinose in corn husk hydrolyzate by m icroorganism

ZOU Hong－fei1，2，+，ZHANG Ze－sheng1，2，+，*，ZHENG M in1，2
(1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，Tianjin University of Science＆Technology，Tianjin 300457，China; 2.Department of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China)

This artic le selec ted the strains that had faster utilization of g lucose and xylose that was unab le to consum e L－arabinose，comparing the separation performance of L－arabinose in corn husk hyd rolyzate by several strains of yeast and m ould.Using five strains of yeast，seven strains ofmould and mould Mgb1，Mgb2 isolated from enviroment to ferment corn husk hyd rolyzate.The results showed that afer four-day fermentation ofTorulopsis，and three-day fermentation ofTrichoderma，Botrytiscinereaand mold Mgb1，Mgb2，the ratio of retention of xylose was less than 5%，and arabinose wasmore than 75%in corn husk hyd rolyzate.It’s separation method thatwas simp le and effective，three strains were used in common and easy to yield，p roviding some extent reference for separetion performance of L－arabinose by m ic roorganism.

corn hust hyd rolyzate;L－Arab inose;Torulopsis;Trichoderma;Botrytiscinerea

TS210.1

A

1002－0306(2012)12－0214－04

2011－09－19 *通讯联系人 +并列第一作者

邹鸿菲(1986－)，女，硕士研究生，研究方向:食品营养。张泽生(1956－)，男，博士，教授，研究方向:营养与功能性食品、天然产物。