基于双向电泳和质谱联用技术的水牛乳源酪蛋白的研究

向明霞，王丽娜，李子超，成希飞，徐明芳

(暨南大学生命科学技术学院生物工程系，广东广州 510632)

基于双向电泳和质谱联用技术的水牛乳源酪蛋白的研究

向明霞，王丽娜，李子超，成希飞，徐明芳*

(暨南大学生命科学技术学院生物工程系，广东广州 510632)

利用双向电泳和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－MS)联用技术对水牛乳酪蛋白与其他乳源蛋白差异性进行了研究。根据Image Master 2D Platinum图像分析软件对不同乳源酪蛋白的双向电泳(2－DE)图谱进行蛋白斑点的匹配分析，获得21个存在于水牛奶中，主要分布在低丰度蛋白区的差异蛋白点，经质谱分析，得到4个属于水牛奶酪蛋白的主要组分，另外发现两个与水牛奶中的蛋白有较高同源性的新组分。

水牛奶，酪蛋白，双向电泳，质谱

差异蛋白质组学是蛋白质组学研究的一个重要内容，其核心在于寻找不同样本之间蛋白质组的区别和变化。当前，差异蛋白质组学的主要研究方法仍以双向电泳(2－DE)分离和质谱(MS)鉴定联合应用为主。以2－DE技术进行研究时，电泳图上的差异蛋白点有三种表现形式:a.电泳迁移率的改变;b.蛋白点的出现或消失，蛋白点浓度的增大或减少;c.某种蛋白点分裂形成的异形体在浓度或位置上的改变［1］。蛋白质鉴定是蛋白质组学研究的一分支，传统的鉴定方法有 Edman降解法、氨基酸分析法等。Edman降解法测定的肽序列非常准确，但速度较慢，费用较高。氨基酸分析法经济快速，但灵敏度低。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI－MS)和电喷雾质谱(ESI－MS)等质谱技术具有高敏感性、高分辨率，是目前进行蛋白质定性研究不可缺少的工具［2-3］。近年来，运用蛋白质组学技术对人、母马以及反刍动物奶牛、绵羊和山羊［4］、小鼠［5］和小袋鼠［6］等乳蛋白质组进行了大量研究，例如，利用2－DE分析热处理对乳蛋白的影响［7］、分析乳蛋白的遗传多态性［8］等。Galvani等［9］选用pH3～7和pH4～7的两种梯度胶条，采用2－DE对奶粉中的蛋白质进行分离，并对凝胶分离到的几个高丰度蛋白质运用MALDITOF－MS进行了鉴定。然而，目前的研究主要集中在全乳蛋白及加工乳蛋白方面，而对水牛奶酪蛋白的研究则较少。本文主要通过2－DE研究水牛奶蛋白的主要组分及一些低丰度蛋白的分离，采用Image Master 2D Platinum图像分析软件对电泳图谱上的水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白及山羊奶酪蛋白进行蛋白斑点匹配，获得差异蛋白，并利用MALDI－TOF－MS和MALDI－TOF/TOF－MS鉴定这些差异蛋白。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巴氏杀菌奶(水牛奶、荷斯坦乳牛奶、山羊奶)零售商;固相pH梯度干胶条 pH4～7，13cm，广州捷倍斯生物科技有限公司;Nuclease Mix、IPG－BUFFER PH4－7NL、硫脲、碘乙酞胺(IAA) 广州佰路生物科技有限公司;丙烯酰胺、Tris－Base、十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT) 广州捷倍斯生物科技有限公司;甲叉丙烯酞胺 广州展晨生物科技有限公司;尿素 Sigma公司;CHAPS、低熔点琼脂糖、乙醇、乙酸、硫代硫酸钠、无水乙酸钠、无水碳酸钠、甲醛、甘油、EDTA等 广州化学试剂厂。

Image Scanner扫描仪 美国 GE公司;4800 MALDI－TOF/TOF串联时间飞行质谱仪 美国ABI公司;KDC－2046型冷冻离心机 科大创新股份有限公司中佳分公司;Image Master 2D Platinum Software

AmershamBiosciences公司产品;Gene Quant pro紫外/可见光分光;EPS－601型 SDS－PAGE电泳仪; Ettan IPGphor3型等电聚焦仪等。

1.2 试剂的配制

1.2.1 储备液 30%聚丙烯酰胺储液(过滤使用，棕色瓶4℃ 冰箱保存);1.5mol/L Tris－Base，pH8.8;电泳缓冲液(含25mmol/L Tris－Base，192mmol/L甘氨酸，0.1%SDS);平衡储液(含6mol/L尿素，30%甘油，2%SDS，3.35%1.5mol/L pH8.8 Tris－HCl);裂解液储液(含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，过滤使用，－20℃冰箱保存);水化储液(含7mol/L尿素，2mol/L硫脲，2%CHAPS，一次性滤膜过滤使用，－20℃冰箱保存)。

1.2.2 实验临用配制的溶液 裂解液(100μL裂解液储液，2μL IPG buffer，1.5μL 0.4g/m L DTT，1μL PMSF，1μL蛋白酶，1μL Nuclease Mix);水化液(500μL水化贮液，3.5μL 0.4g/m L DTT，2.5μL IPG buffer);胶条平衡缓冲液 A(20m L平衡储液，0.2gDTT);胶条平衡缓冲液B(20m L平衡储液，0.5g碘乙酞胺，充分混匀，避光配制);低熔点琼脂糖封胶液(0.05g低熔点琼脂糖，10m L电泳缓冲液，10μL溴酚蓝，加热溶解至澄清，室温保存);敏化液(75m L乙醇。0.79g硫代硫酸钠，10.25g无水乙酸钠，175m L二级纯水);萃取液(50%CAN、5%TFA混合液);脱色液(30mmol/L K3Fe(CN)6和100mmol/L Na2S2O3等体积混合)。

1.3 样品的制备

取新鲜牛奶，4000 r/m in离心30m in，收集下层脱脂乳，调pH至4.6，4000 r/min离心15min。沉淀用蒸馏水洗涤2次，丙酮洗涤2～3次，每次4000 r/m in离心10m in，最后将沉淀自然风干，－20℃冰箱中保存。称取1mg酪蛋白，加入裂解液，振荡，充分溶解后，4℃，4000 r/m in离心1h，取上清液，用brand ford法测量蛋白样品的相对上样浓度，计算上样量(蛋白样品的上样量为60μg)。将蛋白溶液的体积用水化液补充至250μL，振荡混匀样品后，以13200 r/m in、4℃离心30m in取上清液上样。

1.4 双向电泳

1.4.1 第一向等电聚焦 酒精擦拭IPGphor的平板电极，去除表面被氧化的部分，待酒精挥发完全备用;取出－20℃冷冻保存的IPG预制干胶条，室温放置平衡10m in;胶条槽平行放在IPGphor的平板电极上，将样品均匀加入胶条槽中，取室温平衡的胶条，用镊子轻轻的去除干胶条上的保护膜，分清胶条的正负极，将胶面向朝下放入胶条槽中，胶条吸胀15m in;加入1m L覆盖油，防止胶条水化过程中液体的蒸发;对好正负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。S1 30V 12h;S2 500V 1h;S3 1000V 1h;S4 8000V 64000Vh;S5 2000V保持10h。

1.4.2 胶条的平衡 第一次平衡:将聚焦好的胶条用滤纸轻轻吸干胶条上的矿物油，转移至平管加入10m L平衡缓冲液A，胶面朝上放入平衡管中。置于摇床上平衡13min。第二次平衡:倒掉平衡液A，加入平衡液B，同上平衡13min。

1.4.3 第二向SDS－PAGE电泳 将平衡好的胶条用电泳缓冲液冲洗三遍，胶面朝外贴在玻璃外板上，转移到13.5%聚丙烯酰胺凝胶胶面上，轻压胶条使之与胶面充分结合(尽量不要产生气泡)。用低熔点琼脂糖凝胶封胶液封口，放置15m in，待封胶液彻底凝固后，将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时恒流 15mA/块胶，15m in后改为30mA/块胶，待溴酚蓝指示剂达到距底部边缘0.5cm时即可停止电泳。将胶转移到染色盒中固定。

1.5 银染、图像采集与分析

凝胶用含10%乙酸和40%乙醇的固定液固定1h以上;敏化液中敏化30m in;二级纯水漂洗四次，每次10m in;用含0.25%AgNO3，0.04%甲醛(临用前加入)的银染液避光银染30min;二级纯水漂洗3～4次，每次0.5m in;加入含2.5%Na2CO3，0.04%甲醛(临用前加入)的显色液，振荡显色2～10m in，直至出现合适的蛋白点;在含1.46%EDTA的终止液中终止反应10m in。使用二级纯水冲洗胶面，用Image Scanner扫描仪同一参数扫描并保存，然后用Image Master 2D Platinum进行图像分析。

1.6 差异蛋白的胶内酶解

用刀片切下胶上目标胶点，依次置于已编号的EP管中，水洗胶块2次，振荡，吸出液体;加入新鲜的脱色液，待凝胶变成无色时立即吸出脱色液，水洗2次;先用50%乙腈脱水，再用100%乙腈脱水至胶块完全变白，吸出液体;100mmol/L NH4HCO3吸胀5m in，吸出液体，加入新鲜的脱色液，待凝胶变成无色时立即吸出脱色液，水洗2次;每管加入2～4μL酶解工作液，待胶吸胀后，加20μL覆盖液，37°C水浴酶解16h，5000×g离心1m in，上清液移到新的EP管中;在剩余胶块中加入萃取液，37°C水浴30m in，超声10min后离心，上清液转移到对应的装有酶解液的EP管中，混合后于真空干燥离心机中冻干。

1.7 质谱鉴定

冻干样品用2μL样品溶解液溶解，然后与基质工作液按1∶1体积比(0.4μL)点样于样品板上，结晶后进行质谱鉴定。采用ABI4800 MALDI－TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行肽质量指纹图谱(PMF)鉴定，质谱操作采用正离子反射模式，每个样品质谱信号累计扫描600～800次，扫描范围为800～4000u。从一级质谱的肽质量指纹图谱中选择信噪比(S/N)大于50的五个得分最高的前体离子做MS/MS分析，质谱信号累计扫描900～1200次，得到其序列信息，对一级质谱鉴定的蛋白质进行进一步确认。将得到

表1 差异蛋白相关信息Table 1 Information of differential proteins

2 结果与讨论

2.1 乳源酪蛋白差异性的比较

在相同条件下，分别对水牛奶酪蛋白与乳牛奶酪蛋白、山羊奶酪蛋白进行双向凝胶电泳分离，银染后将扫描的图像用Image Master 2D Platinum图像分析软件进行蛋白斑点的匹配分析。在分析报告中，以水牛奶酪蛋白的分离图谱做为参照，选择仅在水牛奶中存在的蛋白质斑点进行标记，共获得21个差异蛋白点。其中，水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白的2－DE图谱分析显示有14个差异蛋白点(图1);水牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白的2－DE图谱分析显示有10个差异蛋白点(图2)。由图可知，三种乳源酪蛋白在主要组分上的差异较小，主要在一些含量较少的低丰度蛋白区有显著差异。

图1 水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白的差异蛋白分析Fig.1 Analysis of differential proteins ofwater buffalo casein and bovine casein

图2 水牛奶酪蛋白和山羊奶酪蛋白的差异性蛋白分析Fig.2 Analysis of differential proteins of water buffalo casein and goat casein

2.2 酪蛋白差异蛋白质的质谱鉴定

挑选2－DE电泳图谱中一些差异蛋白点，经过胶内酶解后进行MALDI－TOF－MS和MALDI－TOF/ TOF－MS鉴定分析。选择一级质谱最多前5个母离子做二级质谱分析，从Mascot软件得到MS和MS/ MS的数据，然后进行NCBInr数据库搜索，按得分、匹配的片段数和覆盖率等进行综合评判搜索结果。肽段或二级片段的得分超过它的阈值(threshold)的被视为鉴定出的肽段和片段，所对应的蛋白质为鉴定的蛋白质，其可信度大于95%，如果有多个结果超过阈值，一般只取排名第一的质谱结果。

差异蛋白点斑点1的PMF图谱见图3。根据适当的荷质比(m/z)选择7个峰进行串联质谱测定(见图4)，得到氨基酸序列，将PMF数据和7个序列的数据进行混合NCBInr数据库查询，获得得分，鉴定出蛋白，用同样的方法鉴定出其他差异蛋白斑点。经质谱鉴定，得到6个差异蛋白点，见表1。结果表明，其中的4个蛋白点是水牛奶酪蛋白的主要组分，其得分分别为366，256，113和110。另外两个可能是某种未知蛋白，因而仅搜索到与之同源性极高的组分，其得分分别为257和88，其肽指纹图谱还有待进一步的研究。

图3 1号差异蛋白质的PMF图Fig.3 PMFmap of differential protein 1

3 结论

现今差异蛋白质组学的主要研究方法仍以2－DE分离和MS鉴定联合应用为主。对双向凝胶电泳分离的蛋白质点进行微量定性鉴定是蛋白质组学研究关键技术之一，肽质谱指纹图分析方法具有高灵敏度、高准确度、高等分辨率及高通量等特点，是2－DE胶上鉴定蛋白质点最广泛使用的方法之一，是生命科学等领域一种强有力的分析测试手段，为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。

本文利用双向电泳和质谱联用技术对水牛酪蛋白和其他乳源酪蛋白差异性进行了研究。水牛奶酪蛋白在双向电泳图谱上根据分子量和等电点的不同，可分离出αs1－、αs2－、β－和 κ－酪蛋白4种主要组分，各组分因分子量和等电点的不同，在图谱上分布于凝胶的不同部位。利用Image Master 2D Platinum图像分析软件分别对水牛奶酪蛋白和乳牛奶酪蛋白、山羊奶酪蛋白的2－DE图谱进行蛋白斑点的匹配分析，获得21个存在于水牛奶中的差异蛋白点，这些蛋白点主要分布在低丰度蛋白区。将差异蛋白点切胶回收，经胰蛋白酶解后，用MALDI－TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行质谱鉴定分析，得到4个属于水牛奶酪蛋白的主要组分，另外发现了两个与水牛奶中的蛋白有较高同源性的新组分，为发现水牛奶中未知蛋白提供了依据。

图4 1号差异蛋白质点的MS/MS图Fig.4 MS/MS spectra of differential protein 1

［1］孙言伟，姜颖，贺福初.差异蛋白质组学的研究进展［J］.生命科学2005，17(2):137－140.

［2］张鹏，朱育强，陈新娟，等.差异蛋白质组学技术及其在园艺植物中的应用［J］.中国农学通报，2011，27(4):212－218.

［3］Roncada P，Gaviraghi A，Liberatori S，et al.Identification of caseins in goatmilk［J］.Proteomics，2002，2(6):723－726.

［4］Molloy M P，Herbert B R，Yan J X，et al.Identification of wallaby milk whey proteins separated by two dimensional electrophoresis，using amino acid analysis and sequence tagging［J］.Electrophoresis，1997，18(7):1073－1078.

［5］Chevalier F，Hirtz C，Sommerer N，et al.Use of reducing/ nonreducing two－dimensional electrophoresis for the study of disulfide－mediated interactions between proteins in raw and HHeated bovine milk［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57(13):5948－5955.

［6］Holland JW，Deeth H C，Alewood P F.Proteomic analysis of κ－casein micro－heterogeneity［J］.Proteomics，2004，4(3): 743－752.

［7］Galvani M，Hamdan M，Righetti P G.Two－dimensional gel electrophoresis/matrix－assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of amilk powder［J］.Rapid Communications in Mass Spectrometry，2000，14(20):1889－1897.

［8］王鸿丽，韩静，李萍，等.双向电泳－串联飞行时间质谱对急性脊髓损伤大鼠差异蛋白质的分离鉴定［J］.分析测试学报，2009，28(5):509－514.

［9］杨永新，王加启，卜登攀，等.基于2－DE结合质谱研究围产期奶牛血浆蛋白表达的变化［J］.畜牧兽医学报，2010，41 (2):188－192.

Analysis of water buffalo m ilk in south China by two－dimensional electrophoresis and mass spectrometry combined technology

XIANG M ing－xia，WANG Li－na，LIZi－chao，CHENG Xi－fei，XU M ing－fang*
(Department of Biotechnology，College of Life Science and Technology，Jinan University，Guangzhou 510632，China)

Two－d imensional elec trophoresis and matrix assisted laser desorp tion/ionization－tim e of flight mass spectrometry(MALDI－MS)comb ined technology was used to analysis the d ifferences between in water buffalo m ilk in south China and other m ilk p roteins.21 d ifferential p roteins which mainly d istributed in areas of low abundance existed only in water buffalo m ilk were identified by com paring two－d imensional electrophoresis (2－DE)map of casein spots m atching analysis w ith software of image m aster 2D p latinum.Four casein frac tions mainly could belong to water buffalo casein and two new fractions which were high homology components w ith water buffalo casein were determ ined w ith the further analysis by mass spectrometry(MS).

buffalo m ilk;casein;two－dimensionalelectrophoresis;mass spectrometry

TS252.1

A

1002－0306(2012)12－0188－04

2011－10－21 *通讯联系人

向明霞(1988－)，女，硕士研究生，研究方向:食品科学。