热激处理对花椰菜小孢子培养的影响

2012-10-19刘希玲文正华

天津农林科技 2012年2期

韩笑，刘希玲，文正华

（1.天津市种子管理站，天津 300061；2.津南区农业技术推广服务中心，天津津南 300350；3.天津科润农业科技股份有限公司蔬菜研究所，天津 300384）

1 前言

花椰菜为十字花科芸薹属甘蓝的一个变种。目前，花椰菜商品种中大多数是F1杂交种，要使其整齐一致，就必须要求制种亲本高度纯合、稳定。常规的亲本获得途径是通过自花授粉和定向选择，需经6～8代，费时费工，且花椰菜多为自交不亲和。运用小孢子培养技术可以快速获得基因型纯合的双单倍体（DH）植株，加速育种进程，将品种培育年限缩短为3～4 a。

花椰菜小孢子的培养最早见于1992年，Duijs等首次报道了花椰菜小孢子的培养，2003年后我国也相继有了成功的报道。但与其它芸薹属作物相比,花椰菜游离小孢子培养比较困难。

本研究对花椰菜小孢子进行热激处理，期望提高小孢子胚胎的发生率，为育种工作服务。

2 材料与方法

2.1 材料

选择天津科润蔬菜研究所温室内花椰菜，于3～4月份取蕾进行试验。

2.2 方法

2.2.1 花蕾大小的选择

选择不同大小的花蕾，加一滴醋酸洋红染液，压片，于显微镜下观察，确定蕾长与小孢子发育时期的关系。选择单核靠边期小孢子比例较大的花蕾进行试验。

2.2.2 培养基配制

小孢子游离与清洗采用B5液体培养基（表1），蔗糖浓度 13%，pH6.0，高压蒸汽灭菌 15 min。小孢子培养采用NLN液体培养基（表2），蔗糖浓度13%，pH6.0，先用0.8μm孔径滤膜抽滤，再在无菌条件下用0.22μm孔径滤膜抽滤除菌。胚状体的分化培养基采用MS固体培养基（表3），蔗糖浓度3%，琼脂0.7%，1 mg/L 6-BA+0.01NAA+0.02IAA，pH5.8。

表1 B5培养基配方

表2 NLN培养基配方

表3 MS基本培养基配方

2.2.3 小孢子游离

选择小孢子处于单核靠边期的花蕾（4.1～5.0 mm）100个，先用75%酒精消毒30 s，再用含2%有效氯的安替福民溶液（次氯酸钠）表面消毒15 min，无菌水清洗3次，每次5 min。加入B5培养基，轻轻挤破花蕾游离出小孢子，用50μm孔径的尼龙筛网过滤，滤液经1000 r/min离心3 min，弃上清液，加B5培养基悬浮沉淀，再重复离心操作两次。第三次离心后，用NLN-13培养基悬浮，用血球计数板调整小孢子密度至（1～2）×105个/ml。分装到直径为6 cm的培养皿中，每皿3 ml，用parafilm封口膜密封培养皿。

2.2.4 游离小孢子培养与胚状体培养

将培养皿放入32.5℃下黑暗处理24 h，然后转移到25℃下暗培养，2～3 d后观察统计胚状体数目，出胚率用每个花蕾的胚状体数目表示。等胚长到一定大小后，转移到MS固体培养基中，在25℃自然光条件下继续培养，诱导再生植株。

2.2.5 热激处理对小孢子胚状体发生的影响

以花椰菜为实验材料，用25℃暗培养作为对照，采用32.5℃黑暗处理24 h和48 h；37℃处理24 h和48 h之后转移到25℃下继续培养，统计不同处理小孢子的出胚情况。