肌萎缩侧索硬化患者脑脊液对间充质干细胞增殖分化的影响

王云甫 杨 超 孙延鹏 孙 强 卢祖能

肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是运动神经元疾病的主要类型，是一种进行性神经变性疾病，由于上、下运动神经元变性导致延髓、四肢、躯干、胸部及腹部肌肉逐渐无力和萎缩，多因呼吸肌麻痹而死亡其发病机制至今尚未完全清楚，也无特效治疗。近年来随着发病机制的研究，提出了许多神经保护性治疗措施，其中干细胞移植被认为是一种最有前景的治疗措施［1，2］。本实验在成功分离大鼠MSCs的基础上通过体外模拟细胞移植的CSF微环境，将ALS患者和正常CSF分别与MSCs共培养，比较MSCs在不同CSF中向神经元细胞增殖分化的程度，初步探讨MSCs在不同CSF微环境中增殖分化的启动机制，为临床MSCs经CSF移植治疗ALS提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 成年健康SPF级SD（Sprague-Dawley）大鼠10只（雌雄不限），体重300 g左右，购自湖北医药学院动物实验中心。主要试剂：低糖DMEM培养基、胎牛血清FBS及小鼠抗大鼠CD29、CD34、CD44、CD45 单 克 隆 抗 体 购 自 美 国Gibco公司。兔抗大鼠NESTIN抗体及兔抗大鼠NSE抗体均购自武汉博士德公司。脑脊液来源于湖北省十堰市太和医院神经内科的住院患者。CSF的获得均经过知情同意，在无菌原则下选择腰椎3-4或4-5椎间隙穿刺。ALS患者的诊断符合1998年修订版E1 Escorial标准。病例对照组为住院头痛患者，经过脑和脊髓影像学检查排除运动神经元病、颅内感染、多发性硬化、脑梗死、脑出血及中枢神经系统肿瘤等疾病，且腰穿CSF常规、生化及细胞学检查均正常。

1.2 大鼠骨髓MSCs的原代培养及生物学鉴定采用密度梯度离心联合贴壁培养的方法分离、培养大鼠骨髓MSCs。健康成年SPF级SD大鼠经过脱臼处死后，75%乙醇侵泡5min后，无菌分离双侧后肢股骨及胫骨，剪去包括骺板在内的骨两端，用10%FBS完全培养基反复冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养皿，反复吹打骨髓细胞悬液至骨髓均匀分散，以106／cm2的密度接种于培养瓶中，加入5 ml低糖DMEM（含10%的胎牛血清、青霉素100 u／ml、链霉素100 u／ml）的培养液，置5%的CO2、37℃的细胞培养箱内，培养48 h后换液，去掉悬浮的细胞，收集贴壁细胞继续培养，之后每隔3 d换液1次。在倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长状况，当细胞生长至80%融合时，进行细胞传代培养。取生长状态良好的第3代（P3）细胞分别加入CD29、CD34、CD44、CD45等单克隆抗体，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达，进行细胞表型鉴定。

1.3 大鼠骨髓MSCs的共培养 取生长状态良好的第3代（P3）细胞，按0.5×105cells／孔的浓度接种于24孔培养板中，孔中预先放置好经过多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片，用以细胞爬片，待细胞生长至80%左右融合时，吸出培养基，将培养板随机分为3组：ALS患者组、病例对照组、空白对照组。ALS患者组每孔加入10 ul ALS患者CSF和1ml培养基，病例对照组每孔加入10 ul正常CSF和1 ml培养基，空白对照组每孔仅加入1 ml培养基。

1.4 细胞增殖活性测定（MTT法） 分别于共培养后第1、4、7 d弃去原培养基，加入 MTT（5 mg／ml）溶液20 ul，37℃二氧化碳孵箱内孵育4 h，小心吸取MTT溶液后，加入二甲基亚砜0.5 ml，振荡15 min，酶标仪上选择波长490 nm，测定吸光度（A）值。

1.5 免疫荧光检测Nestin及NSE的表达水平分别另取上述3组共培养7 d的细胞爬片，吸出培养基，用4%多聚甲醛2 ml固定30 min，蒸馏水洗净后晾干，各组细胞按抗体说明书分别行Nestin和NSE免疫荧光染色，荧光显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 大鼠骨髓MSCs的分离培养及鉴定 以密度梯度联合贴壁培养法获得的骨髓MSCs接种1d后，倒置相差显微镜下可见大部分细胞贴壁生长，贴壁细胞为圆形、椭圆形，有突起，集落样生长，但仍然残留悬浮细胞；48 h首次换液后，在倒置相差显微镜下可见贴壁细胞数量增多，部分聚集成片，并有部分细胞呈扁平梭形，仍有少许悬浮细胞，至第7 d，梭形细胞明显增多，集落逐渐扩大，仅有微量悬浮细胞，贴壁细胞呈梭形，细胞融合约达80%。第3代以后细胞纯度不断提高，形态较为单一，大多数为长梭形，放射状排列（图1）。经流式细胞仪检测，细胞阳性表达CD29（97.15%）和CD44（98.21%），阴性表达造血干细胞标志物CD34（6.05%）和CD45（6.12%），符合 MSCs的细胞表型特征［3，4］。

图1 原代（A）和第3代（B）骨髓间充质干细胞（倒置相差显微镜×100倍）

2.2 共培养后细胞的增殖活性测定 随共培养时间的延长，各组细胞的增殖能力逐渐增加；不同的共培养环境，各组细胞的增殖能力不同。ALS组与病例对照组各时间点吸光度值（A）均明显高于空白对照组，而ALS组与病例对照组各时间点吸光度值（A）无统计学差异，见表1。

表1 各组共培养细胞不同时间点吸光度值（±s，n＝5，A）

表1 各组共培养细胞不同时间点吸光度值（±s，n＝5，A）

注：与空白对照组比较，＊P＜0.01；与病例对照组比较，△P＞0.05

组别 吸光度值1 d 4 d 7d ALS组 0.252±0.026＊△0.747±0.042＊△ 1.173±0.067＊△036病例对照组 0.227±0.028＊ 0.696±0.051＊ 1.098±0.059＊空白对照组 0.137±0.019 0.436±0.052 0.939±0.

2.3 共培养后MSCs Nestin、NSE免疫荧光染色

MSCs和不同CSF共培养7 d后部分细胞开始收缩，并出现细胞突起等出一般形态学变化，出现神经元细胞及神经胶质样细胞形态，而空白对照组细胞形态仍然保持典型的梭形细胞形态。Nestin（图2）、NSE（图3）免疫荧光染色显示，ALS患者组和病例对照组均有阳性细胞表达，光镜下随机数取10个非重叠视野（×100倍），计算Nestin、NSE阳性细胞占总细胞数的比例发现，ALS组与病例对照组Nestin、NSE阳性细胞率均明显高于空白对照组，且ALS组Nestin、NSE阳性细胞率均明显高于病例对照组，见表2。

图2 各组细胞共培养7 d后的Nestin免疫荧光染色（光学显微镜×100倍）

图3 各组细胞共培养7d后的NSE免疫荧光染色（光学显微镜×100倍）

表2 各组MSCs共培养7 d后表达Nestin和NSE的阳性细胞率 （x¯±s，n＝10，%）

3 讨 论

神经系统难治性疾病大多数是由于神经系统损伤而导致大量神经元结构和功能缺失，神经损伤之所以难以逆转是因为神经纤维缺乏再生能力，严重影响疾病的治疗和患者的临床预后转归，成为人们面临的难题。干细胞移植治疗，可从结构和功能上对神经系统进行修复和改善，在一定的条件下骨髓MSCs可以跨胚层分化成神经元样细胞。骨髓MSCs取材和体外扩增较方便，不受伦理学限制，且具有免疫原性弱的特点，可自体移植也可异体移植。近年来，MSCs移植治疗ALS已成为临床研究的热点［5，6］。

目前大多数研究表明，骨髓MSCs在缺血或损伤的脑和脊髓组织中向神经细胞方向的分化与局部损伤组织的微环境变化有关，特别是细胞因子如脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF），表皮生长因子（epidernal growth factor，EGF）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）等的作用。神经损伤时这些细胞因子表达增加，从而促进骨髓MSCs向神经细胞分化［7］。损伤的机体能发出某种特异的分子信号，将干细胞募集到损伤部位并发挥其组织修复功能。干细胞移植并迁移定位到某组织后，在体内微环境的作用下，能定向分化成为所需的组织细胞类型或者可以通过模拟体内微环境，在体外实现干细胞的定向诱导分化。

骨髓MSCs的自我更新、增殖、迁移、分化与其所处的特殊微环境密切相关［8］。CSF中含有多种电解质、蛋白质、糖和其他因子：例如bFGF、BDNF、GDNF等［9，10］。本研究采用不同来源的 CSF分别与MSCs共培养发现，ALS组与病例对照组的CSF均能促进MSCs的增殖，两组细胞的增殖能力无明显差异；培养后7 d可见大量具有典型神经细胞形态的神经元样细胞，且表达神经元特异性表面标志（Nestin、NSE），且ALS组Nestin、NSE阳性细胞率均明显高于与病例对照组空白对照组。我们推测，MSCs的分化需要一定的微环境，不同的CSF为骨髓MSCs的成神经分化提供了不同的微环境；ALS患者的CSF可能存在某些损伤因子，更能促进MSCs向神经元样细胞的分化，从而参与了MSCs定向分化和神经组织修复机制的启动环节。

1 Tripathi VB，Al-Chalabi A.Molecular insights and therapeutic targets in amyotrophic lateral sclerosis.CNS Neurol Disord Drug Targets，2008，7（1）：11-19.

2 Svendsen CN，Langston JW.Stem cells for Parkinson disease and ALS：replacement or protection？Nat Med，2004，10（3）：224-225.

3 Abe K.Pathogenesis and therapeutic perspectives for amyotrophic lateral sclerosis（ALS）.Rinsho Shinkeigaku，2007，47（11）：790-794.

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5 Delorme B，Chateauvieux S，Charbord P.The concept of mesenchymal stem cells.Regen Med，2006，1（4）：497-509.

6 Docheva D，Popov C，Mutschler W，et al.Human mesenchymal stem cells in Contact with their environment：surface characteristics and the integrin system.J Cell Mol Med，2007，11（1）：21-38.

7 Chen X，Katakowski M，Li Y，et al.Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts：growth factors production.J Neurosci Res，2002，69（5）：687-691.

8 Spradling A，Drummond-Barbosa D，Kai T.Stem cells find their niche.Nature，2001，414（6859）：98-104.

9 Grundstrom E，Lindholm D，Johansson A，et al.GDNF but not BDNF is increased in cerebrospinal fluid in amyotrophic lateral sclerosis.Neuroreport，2000，11：1781-1783.

10 Huang CC，Liu CC，Wang ST，et al.Basic fibroblast growth factor in experimental and clinical bacterial meningitis.Pediatric Research，1999，45（1）：120-127.