不同转移潜能肝癌细胞株中CD标志物的表达差异及意义

夏羽佳，余 帆，晏 维，刘 梅，田德安

1.华中科技大学同济医学院附属同济医院消化内科，湖北 武汉 430030;2.华中科技大学同济医学院附属协和医院呼吸内科

原发性肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位于全部恶性肿瘤的第五位，中国是世界上肝癌死亡率最高的国家，占世界肝癌总死亡人数的53%。肝癌患者的预后极差，术后的复发与转移是影响肝癌远期疗效的重要因素［1］。肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中并非所有肿瘤细胞都具有恶性特征，即存在极少量肿瘤细胞，具有自我更新和分化潜能，具有迁移、侵袭、成瘤特性，是肿瘤增殖生长、转移和复发的根源［2］。由于多数器官缺乏特异的表面标记，肿瘤干细胞研究的首要问题就是分离鉴定。

目前，已有CD分子标志物被确定为固体肿瘤干细胞的标记物。CD133是一种造血干细胞表面抗原，最近被确定为脑瘤、结肠癌等实体瘤潜在的肿瘤干细胞标记物［3-4］。CD90(Thy-1)是一种分子量为25～37 KDa的GPI锚定蛋白，其主要由白细胞表达，参与细胞间及细胞基质间的相互作用，它也在骨髓间充质干细胞及肝脏干细胞中表达［5］。CD44，也被称为归巢细胞黏附分子，是淋巴细胞、单核细胞和粒细胞表达的细胞表面糖蛋白，这已被确定为乳腺癌和头颈部癌的干细胞标记物［6-7］。CD24是一种单链唾液酸糖蛋白，分子量为42 KDa，而CD34是一种分子量约110 KDa的单核细胞表面抗原，其选择性地在人类造血祖细胞中表达［8］。本研究拟对不同转移潜能肝癌细胞株中CD133、CD90、CD44、CD34、CD24 这5 种 CD 标记物的表达情况进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料 HepG2、MHCC-97H、SK-HEP-1细胞株由华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所保存。PE-CD133、FITC-90、APC-CD44、PE-CD24、PECD34流式抗体购自美国eBioscience公司，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司。FACS Aria流式细胞仪及分析软件为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及样品制备:高、低转移肝癌细胞株SK-HEP-1、MHCC-97H、HepG2培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM(购自美国Gibco公司)培养基中(培养基中含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)，置于37℃恒温，维持5%CO2饱和湿度培养箱内。细胞长至对数生长期时，PBS洗3次，胰酶+EDTA消化，细胞计数分别收集约1×106个细胞，用预冷的PBS洗3次，1000 r/min离心 10 min，弃上清。

1.2.2 流式抗体染色:在制备好的细胞样品内加入5 μL流式抗体及50 μL PBS缓冲液，混匀悬浮细胞，4℃避光孵育30 min，PBS洗涤3次，1000 r/min离心10 min，留沉淀弃上清，加入400 μL PBS缓冲液悬浮细胞，转移至流式管内用流式细胞仪分析。

1.3 统计学分析 应用SPSS 12.0统计软件进行统计学处理，数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

细胞经流式抗体染色标记后分析CD标志物的表达情况，结果显示:① 在高转移潜能的MHCC-97H、SK-HEP-1细胞株及低转移潜能的HepG2细胞株中均无CD133+CD90+和 CD34的表达(见图 1、图 2);②CD133在低转移潜能的 HepG2细胞中阳性率仅0.1%，在高转移潜能的MHCC-97H和SK-HEP-1细胞中表达水平也较低，分别为0.4%和0.1%(见图1);③CD90在高低转移潜能的细胞株中表达有明显差异，在低转移潜能HepG2细胞中CD90的阳性率仅0.05%，而在高转移潜能的 MHCC-97H和SK-HEP-1细胞中其阳性率分别为0.2%和72.0%(P﹤0.05)(见图3);④ HepG2、MHCC-97H及SK-HEP-1细胞株中CD44阳性率逐渐增加，分别为0.1%、98.2%和99.7%，而 HepG2、MHCC-97H 及 SK-HEP-1细胞株中CD90+CD44+细胞比率分别为0.05%、0.2%和72.0%(见图3);⑤ 在低转移潜能细胞株HepG2中CD44+CD24+占0.05%，低于高转移潜能细胞株MHCC-97H中的10.3%和 SK-HEP-1细胞中的 0.3%(P ＜0.05)(见图4)。

图1 流式细胞仪检测CD133、CD90在不同转移潜能的肝癌细胞株的表达;图2 流式细胞仪检测CD44、CD34在不同转移潜能的肝癌细胞株的表达;图3 流式细胞仪检测CD44、CD90在不同转移潜能的肝癌细胞株的表达;图4 流式细胞仪检测CD44、CD24在不同转移潜能的肝癌细胞株的表达Fig 1 Expression of CD133/CD90 in HCC cell lines detected by flow cytometry;Fig 2 Expression of CD44/CD34 in HCC cell lines detected by flow cytometry;Fig 3 Expression of CD44/CD90 in HCC cell lines detected by flow cytometry;Fig 4 Expression of CD44/CD24 in HCC cell lines detected by flow cytometry

3 讨论

肿瘤干细胞是一类特殊的干细胞，由于其具有自我更新和分化潜能，以及高致瘤性和耐药性的特点，被认为是肿瘤形成及不断生长的根源［2］。肿瘤干细胞通常以干细胞标记物为其特征，特异性分子标志物可用于肿瘤干细胞的鉴定和分选，是研究肿瘤干细胞必不可少的工具，但目前已确定的特异性标志物仍较少。

以往研究表明，CD133抗原是造血干细胞和神经元干细胞的标志，并发现CD133在人胎肝及肝组织的修复过程中有表达。本研究证实高转移潜能的MHCC-97H肝癌细胞中CD133的表达高于低转移潜能的HepG2细胞。Suetsugu等对CD133+肝癌细胞与CD133－细胞的体外增殖能力及成熟肝细胞标记(谷氨酰胺合成酶、细胞色素酶P450)表达情况进行了比较，结果发现CD133+肝癌细胞表现出很强的体外增殖能力并低表达成熟肝细胞标记物［9］。Yin等使用分离的CD133+SMMC-7721细胞株所进行的成瘤实验表明，CD133+细胞与CD133－细胞相比具有高致瘤性和高集落成瘤能力［10］。但是在人类多种肿瘤标本中均可分离出CD133+细胞，目前CD133被认为是脑肿瘤干细胞、直肠癌干细胞、结肠癌干细胞等通用的表型标志物［3-4］，由于其并不具有组织特异性，因此，不是一个特异性较高的肝脏恶性肿瘤干细胞标志物。此外，CD34是一种与新生小血管相关的抗原，主要在血管源性肿瘤及多种肿瘤间质的小血管中表达［8］，但因为本研究所使用的是肝癌细胞株，无新生小血管存在，所以在三种细胞株中均未见CD34阳性表达。

CD90是一种主要在白细胞中表达的糖蛋白，目前发现其在骨髓来源的间充质干细胞及肝脏干细胞上也有表达。CD44作为一种与肿瘤密切相关的跨膜糖蛋白，其过量表达与恶性肿瘤的发生发展、侵袭、转移密切相关［7］。我们的研究表明:CD90和CD44在不同转移潜能的肝癌细胞株中的表达有显著差异，随着转移潜能的增加，两者的表达呈递增趋势;CD90+CD44+细胞比率分别为 HepG20.05%、MHCC-97H 0.2%和SK-Hep-172.0%;并且CD44+CD24+在高转移潜能的MHCC-97H和SK-HEP-1肝癌细胞中表达也高于低转移潜能的HepG2细胞，这表明CD90+CD44+、CD44+CD24+的表达与肿瘤细胞的转移潜能有一定的相关性。新近研究发现来源于肝癌细胞株的CD90+细胞具有致瘤能力;来源于肝癌患者的所有肿瘤组织标本及91.6%的血液样本都具有CD45－CD90+细胞群，这群细胞能在免疫缺陷小鼠身上生成肿瘤结节。此外，CD90+CD44+细胞比CD90+CD44－细胞表现出更具侵袭性的表型，并且前者能在免疫缺陷小鼠的肺部形成侵袭性病灶。同时，CD44的敲除能阻止CD90+细胞形成局部或转移性肿瘤结节［11］。这提示CD90和CD44是潜在的原发性肝癌的干细胞标记物，其可提示肿瘤干细胞的存在。但CD90+CD44+细胞是否具有自我更新及分化潜能，CD24/CD90/CD44的联合标记是否有助于提高肝癌干细胞筛选的特异性，有待进一步研究证实。

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