复方苯乙哌啶对大鼠肠传输功能、病理和神经递质的远期影响

包云光，李小兵，赵 婵

(金华市中心医院，浙江 金华 321000)

·基础与临床研究·

复方苯乙哌啶对大鼠肠传输功能、病理和神经递质的远期影响

包云光，李小兵，赵 婵

(金华市中心医院，浙江 金华 321000)

目的： 通过建立大鼠便秘模型，探讨复方苯乙哌啶对大鼠肠传输功能、病理组织学和神经递质的远期影响及其安全性。方法给健康Wistar大鼠饲喂含复方苯乙哌啶的混悬液为实验组，饲喂普通水作为对照。饲养90天后停药1周，测定肠道传输功能；观察结肠大体形态和病理组织学检查；测定结肠黏膜NO、SP含量及VIP阳性细胞分布情况。结果实验组大鼠日均粪便粒数小于对照组(P<0.001)；实验组大鼠首粒黑便排出时间慢于对照组 (P<0.05)。造模第5天、第90天2组间平均体重差异无统计学意义。2组大鼠结肠黏膜光镜下病理组织学表现类似。结肠黏膜NO、SP含量、VIP阳性细胞分布2组间差异无统计学意义。结论复方苯乙哌啶较长期使用可致肠道传输速度明显减慢，造成顽固便秘, 但对肠黏膜组织病理及肠神经系统递质NO、 SP、VIP的产生均无明显远期影响。

复方苯乙哌啶；传输功能；病理；神经递质；远期影响

Abstract: [Objective] This study was designed to evaluate long-term effects of diphenoxylate on the intestinal transport function, colonic histopathology and the neurotransmitter, and provide a basis for further evaluation of the safety of its clinical application. [Method] Healthy Wister rats were divided randomly into control group and constipation group. In constipation group, the rats were daily administered diphenoxylate to develop slow transit constipated model, while the control rats taken without any drugs. The fecal number, fecal weight and body weight of rats were recorded. Transit functions of intestinal movement were examined. The levels of NO, SP were measured, and the distribution of VIP positive cells was observed. [Result]The fecal number daily in the constipated group was decreased significantly than that in controls (P<0.001). The time of discharge of the first black faeces ，significantly longer than that in controls (P<0.05). The average body weight on the first five days, the 90 days between the two groups had no significant difference. No obvious differences of colonic histopathologic manifestations were observed between the two groups. The differences of NO, SP levels and density of VIP positive cells in distal colonic segment between the two groups had not reached significance. [Conclusion]Diphenoxylate can slow intestinal transit function after longer-term administration, resulting in intractable constipation, but had no histopathological damage on the colonic mucosa，and had no significant long-term effects on the enteric nervous system of NO, SP, and VIP neurotransmitter production.

Keywords: diphenoxylate; intestinal transit function; pathology; neurotransmitters; long-term effects

复方苯乙哌啶(Diphenoxylate)为盐酸地芬诺酯和硫酸阿托品复合制剂，主要作用于U型阿片受体，对中枢神经系统产生镇静、镇痛作用，降低内脏的敏感性，提高胃肠平滑肌的张力，其止泻、缓解腹痛效果明显，见效快，被临床尤其基层广泛应用。长期服用可成瘾,大剂量可致欣快感，过量可致严重的呼吸抑制和昏迷[1]。本研究通过建立大鼠模型，观察体重、大便、病理组织学的变化，测定肠道传输功能和结肠黏膜NO、SP含量，及VIP的分布情况，以了解复方苯乙哌啶较长期使用对肠道传输功能、病理组织学和神经递质、以及机体的远期影响，为进一步评价其临床应用的安全性提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

32只健康Wistar大鼠，雄性，6～8周龄，体重110～130g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，生产许可证号SCXK(沪)2007-0005，随机分为对照组16只和实验组16只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型建立 大鼠模型建立参照刘海峰的方法[3]。大鼠分笼饲养，保持适宜环境，饲以普通级颗粒饲料。3天后开始建立模型，给实验组Wistar大鼠饲喂含复方苯乙哌啶(常州康普药业有限公司生产)混悬液，剂量8mg/kg·d，对照组饲喂自来水。每5日记录一次大鼠大便粒数、干重及大鼠体重。饲养90天。

1.2.2 肠道传输功能测定 采用活性炭灌胃法测定首粒黑便排出时间。停药1周的大鼠禁食24 小时，经口灌入100g/L活性炭悬液2ml。从活性炭灌胃完毕开始计时，记录从灌胃到首粒黑便排出时间。

1.2.3 结肠黏膜NO及SP测定 大鼠经2%戊巴比妥腹腔注射麻醉，通过腹正中切口，切取远段结肠，纵向剪开，在预冷的生理盐水中清洗。经液氮研磨制成10%(质量体积比)匀浆低温离心，留取上清液，-70℃保存待测。NO测定采用硝酸还原酶法，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。SP用双抗体夹心ELISA法检测，试剂盒购自Rapid Bio Lab。

1.2.4 HE染色和免疫组化染色 剪取大鼠结肠远段约1cm，纵行剖开，生理盐水漂洗后，固定于10%甲醛溶液，常规脱水、石蜡包埋切片，分别进行HE染色和免疫组化染色。免疫组化试剂盒购自DAKO公司。VIP为武汉博士德生物技术有限公司产品BA-0134； PBS代替一抗为空白对照；结果：阳性为黄色或黄棕色，细胞核呈蓝色。

1.2.5 VIP计分标准 (1)阳性染色细胞数占视野细胞总数的多少计分为A：没有阳性染色细胞记为-；阳性细胞百分数<25%为+；25～50%为++；>50%为+++；(2)按着色细胞染色强度计分为B：细胞呈阴性染色为-；染色弱，阳性细胞呈淡黄色为+；染色中等，阳性细胞呈棕黄色为++；染色强，阳性细胞呈棕褐色为+++。A和B相加作为判断结果，再做分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS11.0统计软件包进行统计学处理。采用t检验和秩和检验。P<0.05提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠粪便粒数、每日粪便质量及大鼠体重变化

实验组大鼠日均粪便粒数小于对照组，差异有统计学意义，见表1。而日均粪便干重在2组间的差异无统计学意义。造模第5天2组间的平均体重和造模第90天2组间的平均体重差异无统计学意义。实验组大鼠肠道传输速度与对照组相比明显减慢，首粒黑便排出时间延长，分别为(430.2±132.1)min和(337.2±74.7)min，差异有统计学意义(t=-2.450，P<0.05)。

表1 造模大鼠粪便粒数、干重及体重变化

2.2 大鼠结肠大体形态观察和病理组织学检查

实验组结肠较对照组粗大、迂曲。结肠黏膜HE染色显示上皮细胞核呈蓝色，胞浆为淡红色。部分有少量炎症细胞浸润、淋巴细胞聚集等，偶有上皮细胞脱落，未见明显溃疡，2组大鼠结肠黏膜光镜下病理组织学表现相类似。

2.3 结肠远段黏膜神经递质含量变化

远端结肠黏膜NO含量和SP水平在2组间差异无统计学意义，见表2。远端结肠黏膜VIP阳性细胞分布在2组间差异也无统计学意义，见表3。

表2 造模大鼠远段结肠黏膜NO及SP的变化

表3造模大鼠远段结肠黏膜VIP计分结果[累加例数(%)]

VIP计分(阳性细胞数+染色强度)++～+++++合计对照组19(59.4)4(12.5)9(28.1)32实验组21(65.6)4(12.5)7(21.9)32

χ2=0.350，P=0.839

2.4 结肠黏膜NO与NOS含量变化

除了近段结肠黏膜nNOS水平，近端、中段结肠黏膜NO含量、nNOS mRNA表达水平在2组间差异无统计学意义。远端结肠黏膜NO含量、nNOS mRNA表达水平、eNOS阳性细胞分布在2组间差异无统计学意义，见表4。

表4 大鼠结肠黏膜NO ( umol/g protein)、nNOS mRNA(△Ct)和eNOS阳性细胞积分变化

3 讨论

复方苯乙哌啶是非特异性止泻药，直接作用于肠平滑肌，通过抑制肠黏膜感受器，减弱肠蠕动，并使肠内容物通过延迟，而致便秘[4]。通过饲喂复方苯乙哌啶，90天后大鼠结肠大体形态观察实验组结肠较对照组粗大、迂曲，肠腔内有较大块的粪便存留，肠道传输时间显著延长。2组大鼠结肠黏膜光镜下病理组织学表现相类似。造模第5天2组间的平均体重和造模第90天2组间的平均体重差异无统计学意义。显示较长期使用复方苯乙哌啶可致胃肠动力功能障碍，肠内容物滞留于结肠而引起顽固性便秘，与临床上STC的病理生理过程相类似。但不产生病理组织学损害，不造成体重丢失。

研究表明，胃肠动力功能障碍可能与ENS及其递质的异常变化有关[2, 4]。ENS由胃肠道、胆胰系统中所含的神经节间网络组成，对胃肠运动的兴奋、调节和抑制起重要作用。ENS具有复杂多样的神经递质， 通过对其兴奋性递质和抑制性递质的调控而达到调节功能的目的。现已证实，NO是胃肠道主要的抑制性NANC递质[5-6]。当NANC能神经受到刺激时，即释放NO，使其第二信使环磷酸鸟苷增多，胞浆Ca2+外流并抑制Ca2+内流，致使胞浆游离Ca2+浓度降低，平滑肌舒张，胃肠运动减弱。有报道成人功能性便秘患者结肠粘膜下神经丛和肌间神经丛NOS阳性神经元数量和密度均较正常组明显增多、增强，粘膜内NO生成量增加[7]。本研究显示实验大鼠远端结肠黏膜NO含量与对照组比较差异无统计学意义，与文献报道不一致[8]，其原因尚不清楚。

VIP在胃肠运动调节中主要起抑制效应，可通过直接作用于胃肠平滑肌上的VIP受体发挥作用，能引起人结肠平滑肌的舒张[2]。主要支配结肠下行性抑制反射，与结肠节段非推进性运动有关，它的减少会导致结肠节段非推进性运动增多，使结肠出现过度的节段性蠕动，这些肠段的紧缩甚至痉挛使有效推进性运动减弱。我们利用免疫组化技术发现，VIP阳性神经纤维在实验组大鼠结肠黏膜的分布与对照组无明显差异。这与文献资料关于VIP能神经在便秘患者结肠壁内减少似有不符合之处[8]。

SP是兴奋性运动神经元递质，主要存在于肌间神经丛，能抑制胃肠道黏膜分泌，刺激肠道运动。慢传输型便秘患儿腹腔镜结肠活检，免疫荧光染色法测定，发现SP较正常儿童减少甚至缺乏[2]。本研究显示远端结肠黏膜SP含量在实验组与对照组间的差异无统计学意义，与文献报道并不一致。

本研究表明，复方苯乙哌啶较长期使用可致肠道传输速度明显减慢，出现结肠动力减弱，造成便秘，但不产生病理组织学损害，不造成体重丢失。对肠神经系统NO、 SP、VIP递质的产生也无明显远期影响，其内在的作用机制尚待进一步研究。

致谢：该研究得到浙江大学医学院附属儿童医院江米足教授和消化实验室大力支持、指导帮助，特别致谢。

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Long-term effects of diphenoxylate on the intestinal transit function, colonic histopathology and neurotransmitter in Wister rat

BAO Yunguang, LI Xiaobing, ZHAO Chan

(Jinhua Central Hospital, Zhejiang 321000, China)

R333.3

A

1672-0024(2012)02-0043-04

包云光(1961-)，女，浙江东阳人，本科，主任医师。研究方向：小儿消化

金华市与浙江大学科技合作专项资金资助(计划编号:2005-1-303)