肽键构建的新途径

李 扬 徐开俊 郭守河 陆 涛*

（中国药科大学，江苏 南京211198）

酰胺类化合物具有广泛的生物活性，如抗炎、抗变态反应等；同时，它们是一类非常重要的有机合成中间体。制备酰胺应用最广的方法是通过将羧基活化，使羧酸活化为酰氯、叠氮、对称酸酐以及混合酸酐，但是由于这些条件下，存在氨基酸消旋，以及反应试剂危险以及制备比较复杂，逐渐被后来的缩合试剂取代。

尽管使用缩合试剂制备多肽取得了不小的进展，但依然有它的三大局限性。随着多肽类化合物在药物治疗中起到愈加重要的作用，采用化学手段合成多肽显得极为迫切。近几年来，Marder等[1]掀起了采用新的化学合成方法制备多肽化合物的热潮，本综述总结了近几年中在肽键合成领域最具突破性的新方法和新机制，侧重于那些尚未普遍推广，但有可能克服目前合成方法中遇到的困难的新合成途径。

1 具有医学活性的多肽片段的固相合成

多肽的化学合成主要依靠固相合成方法（Solid-Phase Peptide synthesis，SPPS）。该方法按照目标多肽分子的氨基酸序列将其在树脂上依次组装起来，合成策略基本成熟，操作也较为简单，但其合成目标分子的能力依赖于每步的偶联效率。由于在反应过程中各种副产物在树脂上会逐步积累，导致反应产物纯度随肽链增长而显著降低，给目标分子的分离和纯化带来较大的困难。

目前高度优化的固相多肽合成方法也局限于合成约含50～60个氨基酸单元的肽链，因为包含50～60个氨基酸肽链的化学稳定性较差（即避免强酸、强碱、高温等）。此外，由于多肽片段的分子量较大（约3000～10000 Dalton），因此反应溶液中底物的浓度也有较大限制（通常＜0.001mol/L），这些限制使得多肽连接反应成本高，效率低。

2 天然化学连接（Native chemical ligation）及其延伸方法

Native chemical ligation（简写为NCL）是目前发现的最高效的多肽化学合成方法之一。Kent等人发现硫酯Val-SPh和半胱氨酸CysOH能够在水溶液中快速地生成二肽Val-CysOH，而他发明的NCL方法巧妙的利用了要一个C端为硫酯的多肽片段，以及一个N端为半胱氨酸残基的多肽片段（一般为具有特定化学结构的、而且没有保护基团保护的多肽片段），在水溶液体系中进行高度化学选择性的耦合反应，生成连接位点为天然肽键的蛋白质分子[2]。见图1。

利用天然化学连接技术合成的多肽中必须含有Cys残基作为连接位点。研究表明，仅1.7%的蛋白质含Cys残基，而且Cys残基在蛋白质序列中的位置也不一定是很好的缩合位点，因此，研究人员开始对天然化学连接技术进行了延伸，发明了化学区域选择连接（ Chemo- and regioselective ligation）[3]，这是一项拟Cys位点的连接技术，该方法利用C端的硫酯与N端辅助基中的巯基发生酯交换反应，生成新的中间体，该中间体经过分子内的酰基迁移，得到多肽。见图2。

3 施陶丁格连接（Staudinger ligation） 及其改进

施陶丁格连接与天然化学连接方法都是多肽合成的重要方法。见图3。

Bardley等虽然验证了该方法是一种有效的片段缩合方法，但同时发现膦硫酯作为辅助基对一些氨基酸缩合率很低，如以Gly为缩合位点，缩合率不超过35%。Williams等对施陶丁格连接进行了改进，他们使用硫代酸和叠氮化合物反应，得到五元环中间体水解形成肽键。这种新的方法称为硫代酸-叠氮连接（Azide-thioacid ligation）[4]。见图4。

4 酮酸-羟氨连接（Ketoacid-hydroxylamine amide ligations）

加州大学的科研小组发现了一种新的高效而且具备化学选择性的形成肽键的方法，该方法通过脱羧的羟氨和α-酮酸耦合，在不需要添加任何缩合试剂的条件下，直接反应形成酰胺键，副产物为水和二氧化碳。见图5。

5 采用极性反转的方法合成多肽化合物

图1 天然化学连接反应步骤图

图2 化学区域选择连接反应步骤图

图3 施陶丁格连接反应步骤图

图4 硫代酸-叠氮连接反应步骤图

图5 酮酸-羟氨连接反应制备多肽化合物

图6 极性反转法构建酰胺键

图7 极性反转法制备多肽化合物

传统肽键合成采用羧基和氨基通过缩合的方式。但是在遇到空间位阻增加的时候，如二取代胺，芳基甘氨酸等物质，缩合的效果往往不尽如人意，美国范德堡大学（Vanderbilt University）的研究人员发现了一种生成肽键的具有高度化学选择性新方法。该方法使用溴化硝基烷烃与碘活化的胺反应产生酰胺。该反应提供了生产非天然氨基酸酰胺和多肽的新途径[5]。见图6。

图8

当反应分子体积增大、位阻或立体化学复杂程度增强的时候，缩合反应有时就难以达到要求。比如芳香基甘氨酸的肽键生成中就常会伴随一定程度的消旋（导致纯度降低）。而新的这一方法可以和不对称的aza-Henry反应连用，使用溴化硝基烷烃作为羧酸的替代物，与碘活化的胺反应，反应物的极性与经典的脱水缩合反应相反（umpolung），成功避免了芳香基甘氨酸的酰胺产生过程中的消旋[6]。见图7。

研究人员发现溴带硝基烷烃可以提供一个合适的氧化态与氨基接合。见图8。

在酰胺键形成中，先形成亲电性的卤代胺，然后与硝酸酯发生反应，最终脱去硝基形成酰胺键。在反应中NIS（碘代琥珀酰亚胺）起到活化一级或者二级胺的作用，在不加入胺的情况下，会形成α-溴，α-碘的硝基烷烃，从而导致没有目标产物生成。此外溴化硝基烷烃并不与羟基发生类似酯化反应，大大降低了副产物的生成。

6 结论与展望

总体来说，多肽的化学全合成技术还不够完善，合成领域中存在着各式各样的的问题。比如，温度变化会导致多肽的构象改变，如何调整温度达到最佳效果，如何在合成过程中最小化外消旋作用；寻找更好的溶剂和缩合剂来提高缩合率。这一系列问题还有待于进一步研究和探索。

[1] Marder O,Albericio F.Industrial application of coupling reagents in peptide synthesis[M].Chimica Oggi,2003：6-11.

[2] Muir TW.Development and application of expressed protein ligation[J].Synlett,2001(6)：733-740.

[3] Casi G,Hilvert D.Convergent protein synthesis[J].Curr Opin Struct Biol,2003,13(5)：589-594.

[4] Fazio F,Wong CH.RuCl3-promoted amide formation from azides and thioacids[J].Tetrahedron Lett,2003,44(51)：9083-9085.

[5] Carrillo N,Davalos EA,Russak JA,et al.Iterative,aqueous synthesis of β3-oligopeptides without coupling reagents[J].JAm Chem Soc,2006,128(5)：1452-1453.

[6] Shen B,Makley DM,Johnston JN.Umpolung reactivity in amide and peptide synthesis[J].Nature,2010,465(7301)：1027-1032.