2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型的建立及其稳定性评价

戴 冰，杨赛男，肖子曾*，何泽云，周芳亮，黄开颜，刘红宇，邢 瑞

(1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410007)

肾阴虚证本质的研究是中医基础研究的热点和重点之一，中医学认为糖尿病属于“消渴”范畴，其重要病机特点为阴津亏损、燥热偏盛，而以阴虚为本，燥热为标。肾阴虚证是2型糖尿病的基本病理变化特点，约占糖尿病患者辨证的85%以上[1]。因此，对2型糖尿病肾阴虚证的研究对于中医临床治疗2型糖尿病有着重要意义，而2型糖尿病肾阴虚证动物模型的建立是开展病证研究的首要任务。

然而国内外对于2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型的研究却很少，没有公认的造模方法及评价标准，对该模型的稳定性的深入研究也甚少。仅见孙永宁[2]、冯雯[3]等采用皮下注射甲状腺素联合腹腔注射STZ，或腹腔注射四氧嘧啶联合甲状腺素灌胃建立糖尿病肾阴虚模型。但他们仅凭大鼠的血糖、外观体征变化来判断模型建立是否成功，血糖升高只能判断动物为糖尿病模型，其是否是肾阴虚证的判断标准却很模糊，没有具体的生化指标。

本实验采用高脂乳喂养加小剂量STZ腹腔注射后灌服糖皮质激素的方法研究2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型的建立，并通过监测模型大鼠不同时期空腹血糖值及血清cAMP水平来探讨2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型的建立成功与否，以及模型是否稳定。旨在探索判断2型糖尿病肾阴虚证动物模型成模的指标以及可行的造模方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康SD（Sprague-Dawley）大鼠,雄性、体质量180～220 g，购自湖南中医药大学动物实验中心（实验动物质量合格证编号：SCXK(湘)2009-2004）。适应性喂养1周，室温20～24℃，相对湿度40%～70%。普通饲料由湖南中医药大学动物实验中心提供。

1.1.2 试剂 枸橼酸（批号：100823）；磷酸氢二钠（批号:101125）；链脲佐菌素(STZ，批号：S8050，纯度98%）购自Sigma 公司；氢化可的松（批号：11021411，天津药业焦作有限公司；胰岛素（批号: 1102229，江苏万邦生化医药股份有限公司）；环 磷酸腺苷（cAMP）酶联免疫试剂盒（批号: 20111206）。

1.1.3 仪器 快速血糖仪及血糖试纸：美国罗氏公司；冰箱：海尔集团；半自动生化分析仪：ca-958d型；旋涡混匀器：WH-1型，上海沪西分析仪器厂；电子天平：AG204型梅特勒-托利多；水浴锅：北京长源实验设备厂；旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；台式自动平衡离心机：TD4-Ⅱ型，长沙平凡仪表有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高脂乳的制备 按比例配置新鲜高脂乳（30%丙二醇、20%吐温-80、20%猪油、6%食盐、5%胆固醇、5%果糖、5%蔗糖、1%谷氨酸钠、1%丙硫氧嘧啶、蒸馏水适量）。称取胆固醇5 g，蔗糖5 g，果糖5 g，丙硫氧嘧啶1 g，谷氨酸钠1 g，食盐6 g，量取20 mL吐温-80，猪油20 mL，丙二醇30 mL，蒸馏水适量。将猪油置于水浴锅中融化成液体状，并将丙二醇加热，待用。先将胆固醇、蔗糖、果糖研磨成细粉状混合，加适量蒸馏水搅拌均匀后，加入已研碎的丙硫氧嘧啶，搅拌混匀，然后加入已加热成液体状的猪油混匀。将以上混合物与吐温-80加入到已加热的丙二醇中，边加边搅拌，待稍冷却后加入谷氨酸钠和食盐，加入适量蒸馏水至100 mL，4℃保存。

1.2.2 动物分组 SD大鼠随机分为2组：A组（普通饲料喂养组即对照组）6只，B组（高脂乳结合STZ及氢化可的松组即2型糖尿病肾阴虚证模型组）15只。

1.2.3 2型糖尿病大鼠模型的制备 参照文献[4]及预实验结果，模型组给予高脂乳喂养10 mL/（kg·d），空白对照组给予等量蒸馏水。持续10 d后，所有动物禁食不禁水12 h后，模型组大鼠腹腔注射STZ 40 mg/（kg·d），空白对照组腹腔注射等体积枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液。15 min后，给大鼠腹腔注射胰岛素4 U，2.5 h时和5 h时灌胃给予25%葡萄糖10 mL/kg，64 h时开始禁食不禁水，72 h时检测大鼠空腹血糖值。空腹血糖值≥16.7 mmoL/L为方可继续造模。

1.2.4 2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型的建立 在2型糖尿病模型的基础上，采用灌胃糖皮质激素的方法制作肾阴虚模型[5]。2型糖尿病模型大鼠禁食12 h，按照35 mg/kg剂量灌服5 mg/mL/d氢化可的松，连续灌胃4 d，检测大鼠空腹血糖值及血清cAMP，并以大鼠空腹血糖，值≥16.7 mmoL/L且血清cAMP上升者为2型糖尿病肾阴虚大鼠模型；继续高脂乳喂养30 d后，再次检测大鼠空腹血糖值及血清cAMP，对模型稳定性进行评价 。

1.2.5 标本采集 大鼠禁食10 h，腹腔注射10%水合氯醛生理盐水溶液0.35 g/kg麻醉，腹主动脉取全血，静置，分离血清，-20℃冻存待检。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 2型糖尿病肾阴虚证大鼠体征变化

模型大鼠体质量下降，精神不振，活动减少，反应较迟钝，体毛无光泽、粗糙发黄暗淡，大便稍干结，色黑，肛门出现红肿，饮水增加，进食量增加，尿量增加，尿黄，痛阈值降低等，与中医肾阴虚证相吻合。

2.2 2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型血糖值变化

模型组与空白对照组比较，STZ注射72 h后模型组大鼠空腹血糖明显高于空白对照组，比较差异有显著统计学意义（P＜0.01）,大鼠空腹血糖值≥16.7 mmoL/L，2型糖尿病大鼠模型造模成功；造模成功30 天后模型组大鼠空腹血糖仍明显高于空白组，差异有显著统计学意义（P＜0.01），提示该模型稳定性较好。结果见表1。

表1 两组大鼠不同时期空腹血糖值比较（±s，mmoL/L）

表1 两组大鼠不同时期空腹血糖值比较（±s，mmoL/L）

注：与空白对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 n STZ注射72 h后血糖 灌胃氢化可的松后血糖 造模30 d后血糖空白组 6 6.00±0.50 6.00±0.48 6.08±0.35模型组 15 19.50±2.00** 19.40±2.05** 18.40±2.05**

2.3 2型糖尿病肾阴虚证大鼠血清cAMP的变化

与空白对照组比较，模型组大鼠成模时及成模30 d后血清cAMP水平明显高于空白对照组，比较差异有显著统计学意义（P＜0.01），提示该2型糖尿病模型是肾阴虚型，且肾阴虚持续、稳定。结果见表2。

表2 两组大鼠不同时期血清cAMP值比较（mmoL/L）

3 讨论

环核苷酸是调节细胞功能活动的重要物质，cAMP是由ATP 经腺苷酸环化酶及Mg+的作用生成的，能对细胞内很多代谢过程产生影响[6]。许多研究发现，中医阳虚患者的血浆cAMP/cGMP比值降低；而阴虚患者则表现为cAMP含量及cAMP/cGMP比值升高[7]。有研究表明，糖尿病患者的血浆cAMP及cAMP/cGMP比值均发生明显变化[8]。由此可见，血清cAMP含量变化是2型糖尿病肾阴虚证辨证的重要指标。

本实验结果显示，2型糖尿病肾阴虚大鼠在表现出典型的糖尿病症状多饮、多食、多尿、体质量下降，血糖值≥16.7 mmoL/L的同时，血清cAMP水平也明显升高，在2型糖尿病肾阴虚证模型建立30 d后，其血糖值仍≥16.7 mmoL/L，血清cAMP仍明显高于正常对照组，提示大鼠血清cAMP与糖尿病肾阴虚证密切相关,表明大鼠血清cAMP的变化可以作为2型糖尿病肾阴虚证模型成功与否及其稳定性的判断指标之一。

本实验综合借鉴2型糖尿病大鼠[9-10]及肾阴虚大鼠[11]两种模型的造模方法，成功地建立了2型糖尿病肾阴虚大鼠模型，并且以血糖值≥16.7 mmoL/L且血清cAMP上升作为判断模型成功与否的标准，对于2型糖尿病肾阴虚证动物模型的建立及评价有重要的意义。而血清cAMP值究竟要上升多少才可以判断为糖尿病肾阴虚证，以及2型糖尿病肾阴虚证大鼠模型的建立还可以采用哪些指标作为评价指标都需要进一步实验研究来确立。

[1]金智生,杨世勤,潘宇清,等.六味地黄丸对实验性糖尿病大鼠胰岛素敏感性影响[J].甘肃中医学院学报,2008,25(1):9-11.

[2]孙永宁,刘 忠,冯 雯.糖尿病肾阴虚证模型大鼠尿液的代谢组学研究[J].成都中医药大学学报,2009,32(2):69-71.

[3]冯 雯,孙永宁.糖尿病阴虚证动物模型的复制[J].安徽中医学院学报,2009,28(2):40-42.

[4]徐淑云.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2010:1 367.

[5]陈 奇.中药药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版社,2011:1 096-1 098.

[6]黄江荣,李祥华,张家均,等.六味地黄丸对甲状腺功能亢进肾阴虚型小鼠cAMP/cGMP含量和Na+,K+—ATP酶活性的影响[J].中药药理与临床,2011,27(6):1-3.

[7]梁汝圣,徐宗佩.大鼠阴阳虚模型建立方法[J].吉林中医药,2008,28(9):685-687.

[8]李建华,孙元振,刘冬梅,等.糖尿病患者HA/cAMP检测水平观察[J].放射免疫学杂志,2003,16(3):168-169.

[9]叶春玲,庄 岚,卢超霞,等.2型糖尿病大鼠模型的肾脏和动脉血管并发症[J].中国实验动物学报,2007,15(3):161-165.

[10]王宝伟,李 颖,刘晓红,等.高脂饲料喂养时间及链脲佐菌素剂量对实验型2型糖尿病大鼠造模的影响[J].卫生研究,2011,40(1):99-102.

[11]林昌松,李 宁,徐 强,等.知柏养阴汤对阴虚模型大鼠糖脂代谢的影响[J].时珍国医国药,2011,(10):2 404-2 405.