晚期转移性乳腺癌血浆MMP-2、MMP-9检测与化疗疗效相关性研究

陈 蕾 许丽艳

1.汕头大学医学院附属肿瘤医院，广东汕头 515031；2.汕头大学医学院肿瘤病理研究室，广东汕头 515031

晚期转移性乳腺癌血浆MMP-2、MMP-9检测与化疗疗效相关性研究

陈 蕾1许丽艳2

1.汕头大学医学院附属肿瘤医院，广东汕头 515031；2.汕头大学医学院肿瘤病理研究室，广东汕头 515031

目的探讨血浆基质金属蛋白酶活性与晚期转移性乳腺癌化疗疗效的相关性。方法 选择经病理或细胞学确诊的晚期转移性乳腺癌患者，分别于化疗前后收集患者血浆（1.8 mL空腹全血加0.2% mL枸橼酸钠），离心后放置于-70℃冰箱冻存备查。用酶谱法测定肿瘤患者血浆MMP-2及MMP-9的活性，用凝胶图象处理系统分析；以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶的活性。 结果 MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌治疗前后的活性水平测定具有统计学意义。（P＜0.05）。 结论 晚期乳腺癌患者血浆MMP-2、MMP-9活性与病情进展和疗效有一定相关性，而检测方法简单经济，具有一定的临床指导价值。

晚期乳腺癌；基质金属蛋白酶；化疗

多项临床及基础研究表明肿瘤细胞侵袭转移的能力与其诱导产生的基质金属蛋白酶（（matrix metaiioproteinases，MMPs） 的能力有关。为探讨血浆金属蛋白酶活性与转移性乳腺癌化疗疗效的相关性，对转移性乳腺癌患者化疗前后的血浆MMP-2、MMP-9进行检测，以了解化疗对转移性乳腺癌患者血浆MMP-2、MMP-9的活性影响，从而确定血浆MMP-2、MMP-9检测与转移性乳腺癌化疗疗效的相关性。笔者所在科室2004年7月开始对部分晚期转移性乳腺癌患者进行血液标本的收集，并用酶谱法（Zymography）测定患者血浆MMP-2及MMP-9的活性，现将部份结果资料报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

入组32例病例均为笔者所在科室2004年7月～2006年7月收治的患者，所有病例均是经病理或细胞学确诊的晚期转移性乳腺癌患者。患者均为女性，其中Ⅳ期24例，Ⅲ期8例。患者均为腋窝淋巴结阳性，其中第1次就诊腋窝淋巴结3个以内的2例，腋窝淋巴结3～8个的23例，8个以上的6例，腋窝淋巴结情况不明的1例；肺转移9例，骨转移12例，脑转移6例，肝转移3例，胸壁、皮肤等其他部位多发转移9例。患者年龄32～68岁，中位年龄48岁。患者使用的化疗方案包括TP、NP、GL-OHP、CAP等，所有入组患者均予2个疗程以上的2线或3/4线联合或单药方案化疗。随访至2009年12月死亡24例，带瘤生存7例，无复发生存1例（为胸壁转移无复发者）。总有效率为59.4%（CR+PR：19/32），肿瘤控制率为75.0%（CR+PR+SD：24/32），无法评价 9.3%（3/32）。

1.2 MMP-2、MMP-9活性测定

分别于化疗前后收集患者血浆（1.8 mL空腹全血加0.2% mL枸橼酸钠），3000 r/min离心后放置于-70℃冰箱冻存备查。用酶谱法测定肿瘤患者血浆MMP-2及MMP-9的活性；用凝胶图象处理系统分析结果：以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶的活性。

试剂：人血浆MMP-2和MMP-9酶联免疫吸收试剂盒试剂均为美国Bio-Rad公司产品，实验操作按照说明书操作。

试剂：1.0 mol/L Tris-HCl、10%SDS 、10% 过硫酸胺（AP）、1.5 mol/L Tris.HCl（pH8.8）、0.5 mol/LTris.HCl（pH6.8）、0.25%bromophenol blue（溴 酚 蓝）、1% gelatin（明 胶）、2xSDS样 品 缓 冲 液（1.0mol/LTris-Cl，pH6.8，20%glycerol，2%SDS，0.02% bromophenol blue SDS-PAGE，1.0 mol/L Tris-HCl，pH7.5）、10%Triton X-100 洗涤缓冲液（50mM Tris-HCl， pH7.5，2.5%Triton X-100）、孵育缓冲液（50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCI and CaCl2） 0.1%Coomassic Blue（考马斯兰染液）脱色液。

样品制备：患者血浆适量直接与2XSDS样品缓冲液等体积混匀进行以下实验。

电泳：将制备好的样品置于37℃水浴中孵育30 min，稍离心后上样，进行SDS-PAGE电泳。

电泳结束后，取下凝胶，放入平皿中，用洗涤缓冲液在室温摇动下洗涤1 h，其间换液一次。然后加入孵育缓冲液没过胶面，用保鲜膜保好平皿，至37℃恒温箱中，其间换液一次，24 h后取出，弃去孵育缓冲液，加入0.1%考马斯兰染液染色约30 min，回收染液，加入脱色液脱色至蓝色背景和白色条带均十分明显时，用5%乙酸中止脱色。干燥封胶。

用凝胶图象处理系统分析结果：以白色条带的净光密度值相对定量样品中酶的活性。

图1 MMP-9、MMP-2电泳图

1.3 统计学处理

2 结果

MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌的治疗前后的活性水平测定具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 MMP-2、MMP-9治疗前后的活性比较（±s，μg/mL）

表1 MMP-2、MMP-9治疗前后的活性比较（±s，μg/mL）

注：与治疗前比较，*P=0.023；**P=0.019

组别 n MMP-2 MMP-9治疗前 32 33.549 0±15.371 1 17.942 0±12.093 9治疗后 32 22.276 3±16.537 9 * 10.792 0±8.881 1**

3 讨论

恶性肿瘤的侵袭和转移是多阶段、多步骤、多因素和多基因等综合作用和发展的过程。在恶性肿瘤的侵袭和转移过程中会遇到一系列的组织屏障，这些屏障由细胞外基质（extracellular matrix，ECM）中的基底膜及间质、基质所组成，不同的基质成分是由不同的蛋白水解酶（proteolytic enzymes）降解的。水解酶来自瘤细胞自身分泌，也可由局部宿主细胞受诱导而分泌，还可以是基质内原本存在的酶前体激活所致。肿瘤细胞通过其表面受体与细胞外基质成分粘附后， 激活和释放各种蛋白水解酶降解细胞外基质成分，为肿瘤细胞的移动形成通路。而基质金属蛋白酶则是一类与肿瘤侵袭转移密切相关的蛋白水解酶，同时它也是一个锌离子依赖的蛋白酶家族，目前已证实至少有17个亚型，明胶酶是MMPs家族中主要成员之一，分为2个亚型即MMP-2 （72 kD，明胶酶A）和MMP-9（92kD，明胶酶B）[1-2]。MMP-2对基膜主要成分Ⅳ型胶原和层粘连蛋白的降解作用是其丧失完整性的主要原因。MMP-2一方面通过降解基底膜和包绕肿瘤的基质，突破基质屏障，促进肿瘤侵袭转移，另一方面通过毛细血管内皮细胞增生、新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散。 MMP-9对于基底膜中的Ⅳ型胶原蛋白有专一的降解作用，基底膜中的胶原蛋白被降解，其结构即遭破坏，从而失去对肿瘤细胞的阻隔作用。因大部分的MMPs不是直接的活性形式，而是作为无活性的酶原形式，在适当的条件下被激活释放，破坏细胞外基质[3-5]。美国学者Stella Maris Ranuncolo等[6]报道血浆基质金属蛋白酶-9（MMP-9）与乳腺癌患者疾病状态具有相关性，其研究显示血浆MMP-9可能成为临床指导乳腺癌治疗的重要预后指标。国内学者也进行乳腺癌组织中基质金属蛋白酶活性测定的研究，结果显示，乳腺癌组织中MMP-2、MMP-9的活性显著高于纤维腺瘤；而乳腺癌患者中，浸润性癌及淋巴结转移组的MMP-2、MMP-9的活性显著高于非浸润性癌及无淋巴结转移组，从而证实MMP-2、MMP-9的活性部分与乳腺癌的浸润转移有关[7]。何旭等[8]研究发现乳腺癌组织MMP-2的表达明显高于癌旁正常组织，MMP-2的表达与患者年龄、肿瘤大小、组织学分型、临床分期无关，而与组织学分级、淋巴结转移密切相关。李红梅等[9]研究发现MMP-13的表达提示乳腺导管癌局部复发和远处转移的机会增加，基于上述研究，笔者试图用酶谱分析法测得晚期乳腺癌患者化疗前后的血浆MMPs，并探讨结果是否有临床指导意义，因为血浆MMPs是潜在活性的MMPs，它是活化型MMPs的储存方式。经取晚期乳腺癌患者化疗前后的血浆，检测MMP-2及MMP-9水平，实验测得的MMPs活性数据采用配对t检验，结果表明MMP-2、MMP-9在晚期乳腺癌患者治疗前后的活性水平表达存在着统计学差异，且治疗后的活性水平表达比治疗前减少（P＜0.05）。从而推断化疗药物可以降低肿瘤细胞中的MMP-2、MMP-9水平，从而达到减缓肿瘤生长和抑制扩散的作用，这也是化疗有效的客观指标之一。由于本研究取得的样本数量较少，说服力还较差，因此在未来的临床研究中，有必要进一步探讨大组晚期乳腺癌患者的血浆动态MMP-2、MMP-9水平与病情进展和总生存的相关性，也为晚期乳腺癌患者的治疗观察增加的一项分子检测指标。

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Correlational study on advanced metastatic breast cancer plasma MMP-2,MMP-9 detection and the curative effect of chemotherapy

CHEN Lei1XU Liyan2
1.Affiliated Cancer Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515031,China;2.Pathology Laboratory,Affiliated Cancer Hospital of Shantou University Medical College,Shantou 515031,China

Objective To evaluate the bioactivity of plasmatic MMPsand their relevance with chemotherapeutic efficacy in patients with advanced metastatic breast cancer.Methods Plasma samples of patients with pathological or cytological confirmed advanced metastatic breast cancer were collected before and after chemotherapy.The Zymography method was used to determine the bioactivity of MMP-2 and MMP-9,followed by systemic analysis with gel imaging procedure.The optic density of white band was taken as the corresponding bioactivity of quantitative samples.Results The level of MMP-2,MMP-9 in the activity of advanced breast cancer before and after treatment were statistically significant(P＜0.05).Conclusion The bioactivity of MMP-2 and MMP-9 in plasma in patients with MBC before and after chemotherapy has a certain relationship with disease progression and chemotherapeutic efficacy.The detective method is economic and have clinical guidance value.

Advanced breast cancer;Matrix metalloproteinases;Chemotherapy

R737.9

A

2095-0616（2012）01-15-03

广东省汕头市重点科技计划项目（汕府科[2004]102号）。

2011-10-28）