壳聚糖温敏凝胶与富含血小板血浆共混后的微观结构

惠光艳，吴广升，关继东，刘丽霞，贾文敏，王 潍

将组织工程技术引入牙周组织再生治疗，为牙周组织缺损的修复和再生开辟了新的研究空间[1]。寻找合适的支架材料是目前牙周组织再生研究的重要方面。壳聚糖温敏凝胶是一种新型可注射型温敏凝胶，因其优秀的生物学特性，如：生理中性，37℃时可以形成半固体凝胶，可降解性，对大分子药物的缓释性，可以作为活细胞的载体并保持细胞的活性等特点在医学、生物学领域得到了越来越多的关注[2-4]。但壳聚糖温敏凝胶的孔径一般为50 μm左右，远小于理想支架材料孔径的要求。富含血小板血浆（PRP）含有大量的生长因子和丰富的纤维蛋白网络，孔径较大，约为200～800 μm，并已经作为支架材料应用于骨组织工程中[5]。本实验将壳聚糖温敏凝胶与PRP共混，希望使壳聚糖温敏凝胶孔径不仅增大到适宜细胞生长的要求，又可以缓慢释放PRP内的各种生长因子，为其作为支架材料应用于牙周组织再生进行初步研究。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 医用级壳聚糖（博益特生物公司，脱乙酰度91%，青岛），β-甘油磷酸二钠（Sigma，美国），牛凝血酶（Sigma，美国），48 孔板（Corning，美国），乙酸（优级纯，国药集团），磁力搅拌器（正基仪器有限公司，江苏），振荡搅拌器（跃进医疗器械厂，上海），冷冻干燥机（FTS，System公司，美国），扫描电镜（KYKY-2800B，中科院科学仪器厂，北京），离心机（飞鸽，北京）。

1.2 方法

1.2.1 壳聚糖温敏凝胶的制备 参考文献 [6]，将0.2 g壳聚糖加入8 ml 0.1 mol/L乙酸溶液中，磁力搅拌器上持续搅拌2 h；0.56 g β-甘油磷酸二钠溶于2 ml双蒸水中后，两种溶液冰浴15 min，并将β-甘油磷酸二钠逐滴加入到壳聚糖溶液中，并持续搅拌10 min。获得壳聚糖质量浓度为2%，β-甘油磷酸二钠质量浓度为5.6%的壳聚糖/β-甘油磷酸二钠溶液。

1.2.2 PRP的制备 参考文献[5]静脉抽取人全血9 ml放入含有1 ml 3.8%枸橼酸钠抗凝剂的15 ml离心管内，轻柔的上下翻转离心管，使血液与抗凝剂充分混匀。采用2次法离心，常温下1500 r/min离心10 min，将红细胞与血浆分离，再3000 r/min离心10 min，使富含血小板血浆与乏血小板血浆分开，获得约1 ml的富血小板血浆。

1.2.3 壳聚糖温敏凝胶共混PRP 将方法1.2.1制备的壳聚糖/β-甘油磷酸二钠溶液0.4、0.3和0.2 ml分别加入1.5 ml EP管中，再按顺序分别加入0.2、0.3和0.4 ml的PRP，牙周探针充分搅匀后并在振荡搅拌器震荡2 min。这样获得壳聚糖/β-甘油磷酸二钠溶液与 PRP 体积比分别为 2∶1、1∶1 和 1∶2 的共混溶液各0.6 ml，再分别加入48孔板，标记为B、C、D组。然后将纯壳聚糖/β-甘油磷酸二钠溶液0.6 ml加入48孔板标记为A组，纯PRP溶液0.6 ml加入48孔板标记为E组。B～E组再分别加入浓度为1000 U/ml牛凝血酶（含 0.1 g/ml CaCl2）20、30、40、60 μl，并置于37℃恒温孵箱内，10 min后取出放入-80℃冰箱内冻存。

1.2.4 壳聚糖温敏凝胶/PRP大体形态及超微结构观察 将样本从-80℃冰箱内迅速取出并置冷冻干燥机内，真空冷冻干燥48 h，然后用眼科镊小心将样本从48孔板中取出，从各组样本内部分别切取约4 mm×5 mm×3 mm大小长方形样品，先大体观察，然后喷金，扫描电镜观察。

2 结 果

2.1 壳聚糖温敏凝胶的性能 获得壳聚糖/β-甘油磷酸二钠溶液较均匀透明，pH值为7.1，37℃孵箱内约8～10 min形成凝胶。

2.2 制备PRP的检测 将本方法制备的PRP进行血小板计数，约浓缩前的7倍，将1000 U/ml牛凝血酶（含0.1 g/ml CaCl2）溶液按体积比1∶10加入PRP中，立即可以形成果冻样凝胶，表明本方法成功制备出PRP。

2.3 壳聚糖温敏凝胶/PRP大体形态及超微结构 壳聚糖温敏凝胶共混PRP在37℃孵箱内10 min仍然可以形成凝胶。如图1所示：纯壳聚糖温敏凝胶（A组）冷冻干燥后呈白色，质地均匀；随着加入PRP的比例增加，共混物颜色逐渐加深，孔径逐渐增大，断面不规则（B～D 组）；纯 PRP（E 组）孔径最大，颜色最深，呈褐色。扫描电镜放大200倍观察如图2所示：A组（纯壳聚糖温敏凝胶组）呈鱼鳞状，孔径大小比较均匀，50 μm左右，随着加入PRP比例增大，壳聚糖温敏凝胶/PRP的孔径逐渐增大，但大小不再均匀，在一定范围内变化，如B组（2∶1）为30～60 μm；C 组（1∶1）为 100～200 μm；D 组（1∶2）为200～300 μm；E 组（纯 PRP 组）孔径最大，为 200～500 μm。

图1 壳聚糖温敏凝胶/PRP大体形态（A～E组）

图2 壳聚糖温敏凝胶/PRP超微结构（A～E组，×200）

3 讨 论

支架材料是提供体外培养细胞停泊、保证其代谢产物交换的支架，具有模拟细胞外基质组成和结构特性，适宜细胞粘附、增殖的环境。支架材料的孔为细胞提供了生长空间，因此孔的性能（如孔尺寸、孔隙率等）都对支架的性能有重要影响。高孔隙率是理想支架材料的基本要求，为细胞生长提供了更多的结构空间，便于血管长入和材料的降解，有利于支架材料与环境之间的营养交换及新陈代谢。孔径的大小也影响细胞的活动，若孔径过小则没有足够的空间供细胞生长和营养血管的长入，影响细胞分泌基质和营养物质的渗入。有学者认为孔径应>100 μm，最好在 200～400 μm。孔径分布与组织的生长有关，对骨生长，要求支架孔径在100～350 μm范围内[7]。壳聚糖温敏凝胶因其良好的生物相容性，已经被作为种子细胞及各类生长因子的载体广泛应用于各类组织工程中[8]，但其孔径仅为50 μm左右，显然不是很理想，所以笔者希望通过加入其它孔径较大的材料来改良壳聚糖温敏凝胶。

PRP是全血经过浓集、分离而获得的血液制品。其特点是PRP中的血小板浓度是全血的4～5倍以上，并且含有高浓度促进骨组织和软组织再生修复的生长因子。羊书勇等[5]通过扫描电镜的方法观察PRP的超微结构，发现其孔径大小约为200～800 μm。黄爱文等[9]以自体PRP和纤维蛋白胶负载骨髓基质干细胞构建可注射型组织工程骨修复兔桡骨缺损并取得了良好的效果。基于PRP具有较大的孔径和可注射性特点，能否将PRP共混于同样具有可注射性的壳聚糖温敏凝胶中，以便增大壳聚糖温敏凝胶孔径，更有利于细胞的增殖分化。本实验通过将壳聚糖温敏凝胶与PRP按不同体积比进行共混，惊奇的发现随着加入PRP比率增大，壳聚糖温敏凝胶的孔径逐渐增大，壳聚糖温敏凝胶与PRP按1∶1的体积比 （C组）共混时，材料的孔径达到100～200 μm；当壳聚糖温敏凝胶与PRP按1∶2的体积比（D组）共混时，其孔径已经到达200～300 μm，这样的孔径正好是比较适宜细胞生长的。

可注射型支架材料是目前骨及牙周组织再生工程中研究的热门领域，壳聚糖温敏凝胶是一种具有良好的生物相容性可注射型支架材料，不仅可以负载种子细胞并保持细胞的活性，而且还可以负载生长因子并缓慢释放，国内外学者做了很多相关研究[10,11]。PRP含有大量的生长因子，并且可以来源于自体,不会引发肝炎、艾滋病等传染病，是十分安全的自体生长因子。PRP还可促进骨髓间质干细胞和成骨细胞的增殖，与β-磷酸三钙、生物陶瓷、自体骨、异种骨或羟基磷灰石复合,可明显促进骨缺损的修复[12]及促进牙槽骨的再生[13]，已经广泛应用于骨及牙周组织工程中。壳聚糖温敏凝胶和PRP均具有可注射性及良好的生物相容性，二者共混物壳聚糖温敏凝胶/PRP又具有较理想的孔径，相信经过进一步实验，壳聚糖温敏凝胶/PRP有希望作为支架材料在牙周组织再生发挥重要的作用。

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