针刺不同腧穴对失眠模型大鼠脑内神经递质5-HT、DA影响的实验研究*

周艳丽

(河南中医学院针灸推拿学院，郑州 450008)

睡眠占整个生命的三分之一，几乎和食物同等重要。失眠给人们带来的长期痛苦也越来越成为一个公共卫生问题［1］。随着社会的发展，竞争日趋激烈、自然环境变化、生活节奏加快以及人口老龄化及疾病谱的改变，失眠的发病率急剧上升［2］。针灸治疗失眠症有悠久的历史，有着丰富的经验和良好的效果，具有见效快、作用稳定、费用低以及改善晨醒后伴随症状明显等非药物疗法的优点;且经过长期临床检验已证实，针刺治疗失眠疗效确切、作用持久而稳定。但也存在着诊疗标准不统一、治疗方法多样化、选穴组方差异性较大、缺乏相关的实验研究依据等问题。本实验选取临床中最常选用的申脉、照海、神门、内关、足三里和三阴交等穴位，观察针刺上述腧穴对失眠大鼠脑内单胺类神经递质5-HT、DA的影响，为临床治疗失眠选穴提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

对氯苯丙氨酸，吉尔生化(上海)有限公司;兔抗5-HT，武汉博士德生物公司;兔抗DA、SABC染色试剂盒、DAB显色试剂盒、枸橼酸缓冲液、PBS缓冲液均由武汉博士德生物公司提供，其他试剂包括甲醛、H2O2、切片石蜡、二甲苯、乙醇等均由天津市福晨化学试剂厂生产;0.35mmx15mm针灸针，苏州医疗用品厂;MP200A型电子天平，上海精密科学仪器有限公司;电热恒温干燥箱，黄石市恒丰医疗器械有限公司;KD-BM生物组织包埋机，浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;轮转式石蜡切片机，德国Leitz公司。

1.2 动物及分组

健康Wistar雌性大鼠 70只，体重 200g±10g，由郑州大学实验动物中心提供。将70只大鼠随机分为模型对照组、空白对照组、神门组、内关组、三阴交组、足三里组、申脉、照海组7组，每组10只。

1.3 实验方法

实验前分笼饲养1周适应环境，自由进食饮水，室温20℃～25℃，湿度40%～60%。对氯苯丙氨酸(PCPA)用弱碱性生理盐水(PH7～8)配置成30mg/ml混悬液备用。除空白对照组外，其余6组大鼠于每日上午腹腔注射 PCPA混悬液 lml/100g，连续注射2d，空白对照组腹腔注射同体积的弱碱性生理盐水。于第1次腹腔注射28h～30h后，动物出现昼夜节律消失，白天活动频繁，与空白对照组有明显不同，表明模型复制成功。大鼠腹腔注射PCPA造模成功后，于次日开始每天早晨8∶00～10∶00进行针刺治疗，神门组选取神门，内关组选取内关，三阴交取三阴交、足三里组取足三里，申脉、照海组取申脉、照海，空白对照组及模型对照组只抓取不治疗。针刺组参照李忠仁［3］主编的《实验针灸学》选取相应腧穴，以0.5寸毫针进行针刺，平补平泻捻转1min出针，每日1次，连续7d。于末次针刺治疗60min后对大鼠断头处死取脑。

1.4 观察指标

(1)脑组织处理及切片:大鼠断头后迅速将脑取出，在冰床上操作，沿脑正中裂将大脑切为左右两个半球，取右侧脑组织放入4%的甲醛溶液中，4℃条件下固定1周后，行梯度脱水、透明、石腊包埋、切片，每张切片厚6um，进行测定指标的免疫组织化学法染色;(2)免疫组织化学染色:切片常规脱蜡至水，用 PBS(pH7.4)冲洗3次，每次 3min。切片入3%H2O2水溶液室温10min，蒸馏水洗涤3次;切片入0.01M枸橼酸缓冲液(pH6.0)微波加热修复抗原，PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min。滴加正常羊血清封闭，室温下孵育30min，甩去血清分别滴加一抗(兔抗 5-HT、兔抗 DA)，4℃ 过夜。PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3min。滴加生物素化羊抗兔 IgG，室温下孵育30min。滴加试剂SABC链酶亲和素-过氧化物酶复合物，室温下 30min。滴加新鲜配制的DAB溶液，镜下控制反应时间。自来水冲洗后，苏木素复染，上行梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。阴性对照:用正常羊血清代替一抗;(3)镜检:每张切片分别至少观察5个具有代表性的视野，显微镜观察，显示棕黄色颗粒者为阳性，计数每个视野中染色阳性的细胞数。

1.5 统计学处理

统计分析采用SPSS 13.0软件进行。所得数据以均值±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析，以P＜0.05、P＜0.01作为显著性和极显著性差异的标准。

2 结果

2.1 各组大鼠脑内5-HT阳性细胞表达比较

表1显示，干预后模型组与空白组相比，大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量明显减少，差异有显著性意义(P＜0.05);针刺各组与模型组相比，大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量明显增多，差异有显著性意义(P＜0.05);针刺各组与空白组相比，神门组、申脉、照海组、三阴交组大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量明显增多，差异有显著性意义(P＜0.05);内关组、足三里组相比，大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量差异无显著性意义(P＞0.05);与神门组相比，申脉、照海组大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量差异有显著性意义(P＜0.05);与三阴交组、内关组、足三里组相比，大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量增多，差异有显著性意义(P＜0.05);与申脉、照海组相比，三阴交组、内关组、足三里组大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量增多，差异有显著性意义(P＜0.05);与三阴交组相比，内关组、足三里组大鼠脑内5-HT免疫阳性细胞数量差异有显著性意义(P＜0.05)。

2.2 各组大鼠脑内DA阳性细胞表达的比较

表2显示，干预后模型对照组与空白对照组相比，大鼠脑内DA阳性细胞数明显增多，差异有显著性意义(P＜0.05);模型组与针刺各组大鼠脑内DA阳性细胞数比较差异无显著性意义(P＞0.05);针刺各组之间无明显差异(P＞0.05)。

表1 各组大鼠脑内5-HT阳性细胞表达的比较(±s)

表1 各组大鼠脑内5-HT阳性细胞表达的比较(±s)

注:与空白对照组比较:★P＜0.05;与模型对照组比较:▲P＜0.05;与神门组比较:◆P＜0.05;与申脉、照海组比较:△P＜0.05;与三阴交组比较:◇P＜0.05

组别例数 5-HT阳性细胞表达空 白 对 照 组 10 23.00±5.00模 型 对 照 组 10 12.00±1.83★足 三 里 组 10 22.71±6.08▲◆△◇内 关 组 10 28.43±4.72▲◆△◇三 阴 交 组 10 37.14±7.54★▲◆△申 脉 、照 海 组 10 43.71±5.85★▲◆神 门 组 10 46.86±4.22★▲

表2 各组大鼠脑内DA阳性细胞表达的比较(±s)

表2 各组大鼠脑内DA阳性细胞表达的比较(±s)

注:与空白组比较:★P＜0.05

组别例数 DA阳性细胞表达空 白 对 照 组 10 15.71±2.06模 型 对 照 组 10 35.86±2.67★三 阴 交 组 10 33.00±2.88★足 三 里 组 10 34.57±4.89★内 关 组 10 35.57±3.87★申 脉 、照 海 组 10 38.00±3.37★神 门 组 10 38.71±3.64★

3 讨论

睡眠具有明显的随昼夜而变更的时间节律性，卫气昼夜运行节律失调是失眠的主要发病机制。此外，脑为元神之府，若髓海不足、脑失所养，人的思维、感知、睡眠状态皆会出现障碍［4］。据统计，古代文献中记载治疗失眠涉及经脉7条，穴位多达65个［5］。

睡眠是中枢神经系统内发生的一个主动过程，与脑内神经递质的动态变化密切相关［6］。5-HT、DA是大脑内单胺类神经递质，5-HT参与如体温调节、情绪活动、痛觉等多种生理功能的调节，对睡眠-觉醒的调节作用已被多项研究证实。5-HT的各受体亚型具有调节睡眠-觉醒周期的作用，激动突触前5-HTIA自身受体，可延长 NREM(包括 SWS)，减少觉醒，对REM无明显影响;激动突触后5-HTIA受体，可抑制睡眠(包括REM和5WS)并促进觉醒。DA起着维持觉醒和行为兴奋的作用。当各种原因使其维持觉醒和行为兴奋的作用受到抑制时，亦可影响睡眠-觉醒周期［7］。

实验结果表明，针刺各组对腹腔注射PCPA所致失眠大鼠的睡眠具有明显的良性调节作用。针刺各组大鼠脑内5-HT含量有明显升高，但对脑内DA的含量无明显作用，提示针刺各组可能通过提高大鼠脑内5-HT含量、促进睡眠，而非抑制DA合成、抑制大脑兴奋来调节睡眠-觉醒周期，达到治疗失眠的目的。

实验研究提示，针刺对失眠有良好的预防和治疗作用。神门对5-HT的作用最好，申脉、照海治疗失眠的作用仅次于神门，可作为临床治疗失眠的必选穴位。内关、三阴交、足三里对5-HT的作用，可作为临床治疗失眠且符合辨证的首选穴位。

［1］谭永江，王文龙.科学睡眠才能保证健康［N］.科学时报，2007-3-30(B02).

［2］周静媛，王宗涛.疏肝解郁、养血活血法治疗失眠症体会［J］.中国中医药信息杂志，2002，9(8):2.

［3］李忠仁.实验针灸学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:327.

［4］任珊，孙伟霞.高希言教授针刺治疗失眠经验探讨［J］.河南中医学院学报，2008，23(3):49-50.

［5］刘立公，顾杰.难病针灸典籍通览［M］.上海:上海科学技术出版社，2007:150.

［6］刘林方，等.保神开郁冲剂影响失眠鼠中枢递质的实验研究［J］.辽宁中医杂，2000，27(2):92.

［7］刘彬，等.保神开郁冲剂影响失眠鼠中枢递质的实验研究［J］.辽宁中医杂志，2000，27(2):92.