肺结核病人血清差异蛋白的分离及鉴定

李翠萍，胡天桥，农炳金，臧 宁，周 怡，胡水秀，郑艳燕，周昌明，何 敏

（1．广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁530021；2．广西医科大学医学科学实验中心，广西 南宁530021；3．广西龙潭医院，广西 柳州545001；4．广西疾病预防控制中心，广西 南宁530021）

痰涂片是作为活动性结核病简单又快速的检测方法，仅适用于细菌量大于104的痰样本［1］，涂片阴性和潜伏感染的肺结核病人的检测成为结核病预防、控制和治疗的一大难题。因此，通过检测除了痰液之外的其他临床样本比如血液、尿液等来寻找结核病快速和可靠的诊断方法成为了很多研究的热点。本研究的前期工作中，利用SELDI技术筛选出6个肺结核病人血清差异表达蛋白构建诊断模型，明显提高结核病诊断的灵敏度与特异度（另文发表），这6个血清差异表达蛋白分子量分别为M4953．58、M4748．18、M4895．39、M4480．14、M6933．89、M8778．35，其中 M4480．14、M8778．35在肺结核病人血清中低表达。本研究的目的在于分离、鉴定诊断模型中目标蛋白。

1 材料和方法

1．1 血清标本来源 结核组：6例肺结核病人（男3，女3，平均年龄35岁），均为2008年9月在广西南宁市第四人民医院确诊的住院病人，经痰结核菌检查阳性（包括涂片或培养）；胸部X线检查有典型的活动性结核病变表现；临床诊断为结核病并且排除合并其他疾病的病例。正常对照组：6例正常人（男3，女3，平均年龄38岁），为同时期广西医科大学第一附属医院体检中心的健康体检者，既往无与肺结核病类似的呼吸系统疾患，胸部CT检查未见异常，无消化系统疾患，在全身体检中未发现任何疾病。

1．2 实验方法

1．2．1 样品的收集 所有血样均于清晨空腹采集，用无抗凝剂的5ml普通采血试管，冰上分装血清并－80℃低温保存。

1．2．2 Tricine－SDS－PAGE 电泳分离差异表达蛋白 分别等体积混合6例正常人血清和6例肺结核病人血清，将混好的样品经过两倍的乙腈、离心和冻干处理后，取20μl加尿素的Tricine－SDS－PAGE检测。切取差异条带，胶内酶解样品。

1．2．3 LC－MS／MS鉴定差异表达蛋白 消化好的样品用C18反相柱（美国Agilent公司）分离并进行串联 LCQ－DECA－XP（Thermo Finnigan公司）plus电喷雾离子阱质谱鉴定。多肽离子检测范围为400－2000amu，随后进行二级质谱鉴定。二级质谱数据用SEQUEST （Bioworks 3．0）软件进行检索。搜索使用的蛋白数据库为ipi．HUMAN．v3．36蛋白库。SEQUEST结果过滤参数为：当Charge＋1，Xcorr≥1．9；当Charge＋2，Xcorr≥2．2；当Charge＋3，Xcorr≥3．75；其中DelCN≥0．1。

2 结果

2．1 Tricine－SDS－PAGE电泳分离 对经乙腈沉淀法处理后的肺结核病人和正常人血清样本进行3次重复电泳图，蛋白质条带的重复性较好。图1显示其中一张血清电泳图谱，14．4KD以下小分子量蛋白条带清昕可见，箭头所指条带在正常人血清的浓度明显高于肺结核患者血清且分子量小于6．5kD，与前期诊断模型中潜在标志蛋白M4480．14分子量分布范围和表达水平均一致。对这一条带切胶酶解后质谱鉴定。

图1 Tricine－SDS－PAGE电泳分离图

2．2 串联LCQ－DECA plus电喷雾离子阱质谱鉴定

按照方法1．2．4设置SEQUEST过滤参数共鉴定出12个蛋白，图2显示的是质谱鉴定Basepeak图及其中一个母离子的二级质谱图。在这12个蛋白中apolipoprotein C－I precursor可信度最高，覆盖率达39．76%，且有5个不重复的肽段被鉴定（如表1所示）。

图2 蛋白条带的质谱鉴定图

2．3 目的蛋白的确定及其生物信息学分析 在NCBI蛋白数据库里搜索人类apolipoprotein C－I precursor的氨基酸序列为82个氨基酸。本研究所鉴定到的5个不重复肽段，分布于第36－75位之间的40 个氨基 酸。查 询 http：／／www．expasy．ch／tools／#proteome网站发现这40个氨基酸组成的多肽存在多个酶切位点，其中酶切片段efgntledkarelisrikqselsakmrewfsetfqkv理论分子量为4433．02Da，与本研究SELDI筛选出6个肺结核病人血清差异表达蛋白构建诊断模型中潜在标志蛋白4480．14Da分子量非常接近，因而判断SELDI检测到4480．14Da潜在标志蛋白可能为apo C－I的酶解片段。

表1 Apo C－I肽段匹配情况

3 讨论

质谱技术鉴定蛋白的发展激起人们发现和鉴定结核病新的标志物的兴趣。蛋白鉴定的重要意义性在于每一个蛋白都具有可以改变的细胞功能，与结核有密切联系的蛋白，在疾病状态时发生改变并可能释放进入血液中，鉴定血清中的这些蛋白有助于阐明结核病发病机理，使寻找结核病标志物成为可能。

利用蛋白质组技术研究血清标志物受到血清中高丰度蛋白蛋白的影响，正常人血清中的20余种高丰度蛋白占血清总蛋白的99%以上，其余的上千种可能与疾病诊断密切相关的小分子蛋白含量甚微［2－4］，同时，血清中蛋白质浓度的动态范围变化很大，至少达到109数量级，因而很难在最大辨别幅度仅为104聚丙烯酰胺凝胶上得以显示，众多高中丰度蛋白的存在必然严重干扰小分子蛋白质的分离［5］。因此高丰度蛋白的去除和低丰度蛋白的富集己成为血清样品处理中的首要步骤，通过这个步骤可明显提高低丰度蛋白质的上样量、色谱分离的峰容量和质谱检测的动态范围等［6－9］。有研究表明与其他有机溶剂相比，乙腈沉淀法是一种去除高丰度蛋白重复性和效果最好的方法，在血清中加入两倍的乙腈，能够有效的破坏小分子蛋白与白蛋白的结合，降低生物标志物丢失的可能［10］。CHERTOV［10］等亦用高效液相串联电喷雾质谱的方法发现血清用乙腈沉淀后能发现更多小分子量蛋白和肽峰，得出此方法能使结合在白蛋白等载体蛋白的小分子蛋白和肽分开的结论。同样地，Richard［11］也指出乙腈沉淀法能够简便、快速地、重复性好地去除血清中高丰度蛋白，已经成为一种普遍应用的质谱鉴定的前期处理方法。本研究通过乙腈沉淀法处理血清样品，电泳结果清晰地呈现了10KD以下小分子蛋白条带。

在结核病血清标志物的鉴定方面已有一些报道，比如，Agranoff等［12］鉴定出2个最有鉴别力的标志物，一个是血清淀粉A，另一个是转甲状腺素蛋白。吴雪琼等［13］采用SELDI技术筛选肺结核差异蛋白并采用 C18－HPLC 分离和 MALDI－TOF－MS跟踪方法，成功地对质荷比峰为5643m／z的蛋白进行了分离、纯化，并应用LC－MS／MS鉴定为粘蛋白。本研究经过3次的SDS－PAGE分离肺结核患者和健康人血清蛋白质，均发现一条分子量小于6．5KD的差异蛋白质条带，LC－MS／MS鉴定为apo C－I蛋白的酶解片段。Apo C－I是载脂蛋白A家族中组分之一，在血清中含量较低，关于其在体内确切的生物学功能尚不清楚。近年来，有人曾报道apo C－I是结肠直肠癌、前列腺癌和肝纤维化的潜在血清标志物［14－16］，但其与肺结核的关系尚未得知。近期不少研究者研究结果证实肺结核病的发生、发展与载脂蛋白有着相 当 密 切 的 关 系［11，17，18］，说 明 载 脂 蛋 白 类代谢途径与结核病的发生发展有关。大多数的肺结核病人都会出现消瘦，乏力等症状，这些症状或许跟脂类代谢失调有关，Perez［19］等已证实肺结核病人血清的总胆固醇水平低于正常人。Deniz［20］等发现肺结核病人组的血清胆固醇、甘油三脂、高密度脂蛋白复合物，低密度脂蛋白复合物的浓度显著低于正常人，其中上述指标涂阳病人又低于非涂阳的，开放性肺结核又低于涂阳的。同时有研究表明［18］apo C－I结构、水平与功能的异常与人的脂类代谢失调的疾病有关，在高甘油三酯血症中起着重要的作用，因此apo C－I很可能与肺结核的发生发展有关，可能是结核病血清潜在标志物之一。

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