体外定向诱导脐血间充质干细胞分化为心肌样细胞

赵洪昌，赵文静，刘 薇，叶冬霞

（1．长春急救中心，吉林 长春130062；2．吉林省肝胆病医院，吉林 长春130062）

间 充 质 干 细 胞 （Mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有多向分化潜能的干细胞，具有高度可塑性，在特定的诱导条件下可分化为不同胚层来源的细胞，其生物学特点使其在临床治疗如组织和器官修复等方面具有广阔的应用前景［1，2］。在一定诱导条件下MSCs可分化为中胚层的骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞，外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的肝细胞［3－5］。MSCs向心肌细胞的分化为扩张性心肌病、心肌梗死等的治疗带来了新的希望。研究证明，5－氮胞苷可诱导MSCs定向分化为心肌样细胞，但如何诱导MSCs定向分化为心肌细胞仍是需要重点研究的问题，为此本研究在分离培养脐血MSCs的基础上，采用5－氮胞苷诱导培养脐血MSCs分化为心肌样细胞，为临床应用MSCs治疗心血管疾病提供实验基础和理论依据。

1 材料和方法

1．1 材料

低糖DMEM培养基（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青）；胰蛋白酶、5－氮胞苷（Sigma）；脐血／骨髓干细胞处理试剂盒（宁夏中联达公司）；鼠抗人肌钙蛋白（cTnT）单抗（丹麦DAKO公司），SP免疫组化试剂盒（迈新公司）。

1．2 脐带血采集

选择30岁以下剖宫产妇采集脐带血，孕妇健康、无急慢性疾病，抗HIV、抗HCV及乙肝病毒标志物检测均为阴性。此项研究经医院伦理委员会批准，前期告知孕妇并签署知情同意书。新生儿产出后立即在距脐轮5－7cm处钳夹结扎脐带并切断，行脐带静脉穿刺直接将脐血引流入装有枸橼酸钠抗凝剂的一次性采血袋内，脐带血采集完毕后置冰盒内运输至实验室进行细胞分离培养。

1．3 脐血MSCs的分离培养

脐血单个核细胞的分离采用脐带血细胞处理试剂盒，严格按照试剂盒说明书操作。分离后计数并检测细胞存活率（台盼蓝染色）。分离获得的单个核细胞，无血清DMEM培养液洗2次，以2×106／ml接种于60mm培养皿内，培养72h后换液，以后每3－4d换液1次，约10－1 4d细胞80%融合时，胰酶消化传代培养。镜下逐日观察细胞生长情况。

1．4 脐血MSCs的表型和分化潜能鉴定

取3代脐血MSCs细胞以1×104／孔接种于24孔培养板中（孔中预先放置无菌盖玻片），二氧化碳培养箱培养，待细胞生长接近80%融合时，取出盖玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定10min，免疫组织化学染色检测细胞表面分子CD29、CD44、CD34的表达；

根据文献［6］。3代脐血 MSCs的细胞，含20%马血清的培养基诱导培养，隔日换液；对照组取同代细胞，常规培养液培养。诱导培养基培养14d后取出中盖玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定10min，油红O染色鉴定细胞分化情况。

1．5 5－氮胞苷诱导培养脐血MSCs

取第3代MSCs，以细胞浓度1×105／mL接种于6孔板内（孔内预置无菌盖玻片），培养24h更换培养基为含10μmol／L 5－氮胞苷低糖DMEM培养基，继续24h后弃去培养液，PBS洗涤2次，更换为常规培养基培养；对照组始终采用常规培养基培养。培养不同时间点取出盖玻片，4%多聚甲醛固定10min，风干后保存于－20℃待检。

1．6 免疫组织化学法检测脐血MSCs的表达

严格按照试剂盒说明书进行操作。取出已固定细胞爬片，PBS湿化20min，3%H2O2甲醇液封闭内源性过氧化物酶，PBS冲洗后，滴加正常山羊血清封闭30min，滴加鼠抗人cTnT单抗（1∶200稀释），对照组用PBS代替，37℃孵育1h，PBS冲洗后滴加辣根过氧化物酶标记兔抗鼠二抗，37℃孵育30 min，PBS冲洗，DAB显色，封片，镜下观察染色结果。结果判定：阳性细胞胞浆内出现棕褐色颗粒，显微镜下计数5个低倍视野，计算阳性细胞百分率。

1．7 统计分析

实验数据以¯x±s表示，两组数据间比较用两样本t检验。采用SPSS13．0软件包进行统计学分析。

2 结果

2．1 脐血MSCs的分离培养、表型和分化潜能鉴定

从脐带血分离的单个核细胞培养72h后换液，部分细胞贴壁并分裂增殖形成集落，随着培养时间的延长，细胞集落不断增多，扩大，约10－14d细胞融合，进行传代培养。传代脐血MSCs很快贴壁，呈梭形均匀分布，增殖迅速，传代周期为6－7d（见图1）。

免疫细胞化学染色结果显示：脐血MSCs高表达CD44和CD29，不表达CD34。成脂肪诱导组细胞变得稍大而扁平，油红O染色后镜下观察可见，细胞核呈浅蓝色，胞浆内有橘红色脂肪滴；对照组细胞无形态改变，油红O染色后胞浆内无橘红色脂肪滴（见图2）。结果表明，脐血MSCs可定向诱导分化为脂肪细胞。

Fig．1 Morphological features of human cord blood MSCs（×40）

Fig．2 Red oil O staining of human cord blood MSCs（×200）

2．2 诱导培养组MSCs的形态学观察和cTnT的免疫组化染色结果

对照组MSCs未发生形态改变，呈成纤维细胞样整齐排列；5－aza诱导组MSCs生长状态良好，培养7d细胞形态发生明显变化，呈紧密平行排列生长，体积变大，随着培养时间的延长，多数细胞呈杆状，少数细胞呈不规则外形，相邻细胞间的胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状。

5－aza诱导组 MSCs培养7d、14d、21d、28d cTnT均呈阳性表达，其表达阳性率分别为（17．2±4．2）%、（21．5±5．8）%、（42．3±8．5）%和（70．4±11．5）%，随时间延长cTnT表达阳性率增高，不同时间点阳性率比较差异有统计学意义（P＜0．05）；未经5－aza诱导的MSCs中未见cTnT表达。

3 讨论

大量研究已表明，脐带血中含有大量的造血干细胞以及丰富的MSCs，脐带血干细胞的体外增殖、分化能力、集落形成能力、刺激后进入细胞周期的速度以及自泌生长因子的能力均强于骨髓及外周血来源干细胞，脐血为一种良好的 MSCs来源［7，8］。本研究采用密度梯度离心和贴壁培养法相结合分离培养脐血MSCs，结果显示，密度梯度离心获得的单个核细胞培养72h后大部分细胞贴壁，呈集落式生长，传代细胞增殖迅速、呈均匀有序的成纤维细胞样分布，传代周期为6－7d。体外鉴定MSCs主要是根据细胞的形态和培养特性、表型以及分化潜能等，本研究从脐血分离的MSCs高表达表面分子CD44和CD29表达，不表达CD34表达，体外可定向诱导分化为脂肪细胞。研究结果表明密度梯度离心和贴壁培养法相结合可获得较纯化，高活性的脐血MSCs，与文献报道一致，为进一步实验奠定了基础。

Fig．3 The morphology feature and expression of cTnT in MSCs（×100）

MSCs具有多向分化潜能，可定向分化为心肌细胞和血管内皮细胞，MSCs已经成为心血管疾病细胞移植治疗的理想种子细胞，是近年来心血管疾病领域的研究热点，5－aza是目前公认的可以诱导MSCs向心肌细胞分化的药物。cTnT是心肌肌钙蛋白中具有较高特异性的亚型，是鉴定心肌源性细胞的特异性标志物［9，10］，本研究采用5－aza对 MSCs进行诱导培养，并采用免疫组织化学染色鉴定cT－nT的表达。研究显示5－aza诱导培养组MSCs生长状态良好，7d后细胞的形态出现变化，多紧密平行排列生长，体积变大，随着培养时间的延长梭形细胞的比例下降，多呈杆状，少数细胞呈不规则外形，相邻细胞间的胞膜有接触，排列具有方向性，逐渐相连呈肌管状。诱导组在7d、14d、21d、28dMSCs的cTnT均呈阳性表达，cTnT表达随诱导培养时间延长表达逐渐增强；未经5－aza诱导MSCs中未见cTnT表达。

综上所述，本研究从脐带血中成功分离高纯度和活性的MSCs，并采用5－aza定向诱导分化为心肌细胞，为进一步应用脐带血MSCs治疗心血管疾病实验奠定了基础，相关研究正在深入进行中。

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