Top2A基因及其蛋白与Ki-67蛋白在三阴乳腺癌患者中的检测意义

马 杰，魏 冰，杨 科，崔树德

(河南省肿瘤医院病理科 河南郑州 450003)

三阴乳腺癌患者缺乏有效的靶向治疗，化疗是目前唯一的系统治疗手段，尤其是以铂类为基础的化疗［1，2］。Top2A 做为铂类药物的靶点，近年来一直为广大学者所关注［3，4］。本研究检测Top2A的基因改变及蛋白表达水平，联合Ki-67蛋白表达情况，探讨蒽环类药物治疗的可能性。

1 材料与方法

1.1 标本来源选择 2008年1月至2009年9月我院手术切除或粗针穿刺活检的47例三阴乳腺癌标本，所有患者术前均未接受任何治疗，标本经10%的中性缓冲甲醛固定6～48 h，石蜡包埋，切片2～4 μm，经 HE染色证实为浸润性导管癌，用IHC法测定ER，PR，HER-2蛋白表达阳性的标本，HER-2(2+)患者再进一步用FISH法检测HER-2基因扩增情况。确证研究病例为三阴乳腺癌。

1.2 主要试剂 Top2A、Ki-67鼠抗人单克隆抗体及IHC试剂盒购自上海基因公司;FISH法Top2A基因扩增检测试剂盒购自北京金菩嘉医疗科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 IHC法:采用免疫组化Envision法检测Top2A、Ki-67蛋白表达，阳性反应物为棕黄色颗粒，定位于细胞核。高倍显微镜下观察10个视野，计算百分比。

1.3.2 FISH法:采用FISH法检测Top2A基因的扩增情况，该方法可将Top2A基因标记为红色，17号染色体标记为绿色。制片后于荧光显微镜下观察。观察30个肿瘤细胞，计算Ratio值(Ratio值=30个细胞核中红信号总数/30个细胞核中绿信号总数)。Ratio＜1.8为阴性，提示该样本Top2A无基因扩增;Ratio＞2.2为阳性，提示样本中Top2A基因扩增。红信号点成簇扩增，也记为Top2A基因扩增阳性。Ratio在1.8～2.2之间时，增加计数细胞至100个重新计算，或重做FISH试验来判断最终结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，两变量相关性分析采用Spearman等级相关分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 Top2A基因表达与蛋白表达 47例三阴乳腺癌患者中，Top2A基因异常的11例，构成比为23%。其中扩增4例，缺失7例。Top2A的扩增多表现为成簇，见图1。缺失主要表现为17号染色体特异信号呈单一绿色或缺失。IHC法检测Top2A蛋白发现47例患者中 ＞10%的阳性病例为 36例，构成比76.6%。Top2A的表达部位为细胞核，核内见大量棕色颗粒，分布呈簇状或弥散于核内。Top2A基因改变与蛋白阳性表达的总符合率为29.7%。本研究对Top2A蛋白阳性病例(＞10%)进行分组，10%～40%为低表达组，＞40%为高表达组，Top2A基因异常表达率分别为42%和23%。统计结果显示:Top2A基因异常的病例与Top2A高表达组具有显著相关性(r=0.873，P＜0.005)。其中以扩增病例最为显著(P＜0.001)，提示Top2A的异常扩增可能引起Top2A蛋白表达上调。

图1 FISH法检测Top2A基因

2.2 Top2A蛋白表达与Ki-67蛋白表达的关系 Ki-67蛋白表达位于细胞核内，分布多为灶性，呈颗粒状或不均一状。按分类标准把47例三阴乳腺癌患者划分为3组，正常组＜14%，低表达组14%～40%，高表达组＞40%(见图2)。47例患者Ki-67的指数分别为正常组 17%，低表达组 21%，高表达组 62%。Spearman等级相关分析，Top2A、Ki-67蛋白表达同为高表达病例16例，占34%。两者存在显著相关，而正常组与低表达组统计显示无相关，见表1。

图2 免疫组化染色检测Top2A蛋白

表1 Top2A蛋白表达与Ki-67增殖指数的比较

2.3 Top2A基因改变与Ki-67蛋白表达的关系FISH技术检测47例三阴乳腺癌患者发现Top2A基因改变类型主要为扩增与缺失，其中扩增4例，缺失7例，构成比分别为9%和15%。Top2A基因改变与Ki-67高表达组的符合率为100%。Spearman等级相关分析扩增与缺失发现，Top2A基因缺失与Ki-67增殖无相关性。

3 讨论

乳腺癌是一种多因素疾病，其临床病理分子生物学特征非常丰富，依据组织病理学特征、基因变异与基因分布可分为不同的亚型，三阴乳腺癌(triple negative breast canler，TNBC)是其中的一种。该类患者转移早，复发率高，无病生存率(DFS)与总体生存率(OS)低，治疗上缺乏有效的靶向治疗，化疗是目前唯一的系统治疗手段。有报道认为，以铂类为基础的化疗可提高三阴乳腺癌的敏感性［5，6］。

Top2A是一种编码拓扑异物酶的编码基因，位于17号染色体，是蒽环类药物的作用靶点。近年来，大量文献报道，Top2A与Her-2基因共表达，由此推测，Top2A与Her-2共表达的患者可以从蒽环类化疗中获益，而Her-2阴性患者则相反。Gehrmann等［7］的研究发现，对Her-2阴性但具有Top2A高表达的患者，使用蒽环类药物同样可以从临床治疗中获益，有些临床试验结果表明，Top2A对蒽环类药物的预测作用不依赖于Her-2基因表达，Top2A是否扩增与缺失，与Top2A和RNA表达量有关。普遍认为Top2A对蒽环类药物的预测结果不一致与Top2A的检测方法及计算方式有关。Top2A联合其它指标预测蒽环类药物的疗效是目前研究的热点之一［8］。

Ki-67蛋白是反映细胞增殖活性的常用指标，它是一种定位于细胞核，半衰期短与增殖相关的非组蛋白性核蛋白，存在于细胞周期中除Go期以外的所有阶段，多项研究表明Ki-67抗原表达可反映肿瘤的细胞增殖活性，与恶性肿瘤的发展，转移和预后高度相关。Gualneri等［9-11］研究结果显示对三阴患者术前使用辅助化疗，观察Ki-67具有独特性的临床价值，同时认为Ki-67是一种独立的预测治疗敏感性指标。

本研究采用免疫分型方法将乳腺癌患者分类:47例患者中包括basal-like型及TNP-nonbasal型。运用FISH方法确定Top2A是否扩增与缺失。IHC法确定Top2A蛋白表达量与Ki-67比较，结果显示在Top2A基因改变患者中(包括扩增与缺失)，Top2A的蛋白表达上调，统计学显示有显著相关(P＜0.001)，同时该组患者Ki-67增殖大于40，而无Top2A基因改变中，尽管存在由Top2A蛋白的高表达，同时Ki-67高表达，3者之间统计学显示无相关性，在Top2A蛋白表达组(＞40%)，Ki-67由大量表达，两者之间存在相关性(P＜0.05)。提示Top2A蛋白是否存在引起Ki-67高表达的机制。Top2A的基因扩增或缺失，是否可能引起Top2A蛋白的异常表达。深入工作有待深入研究。

联合运用生物学指标预测蒽环类化疗药物疗效历来被人们所关注。运用Top2A Ki-67蛋白表达做为指标筛选蒽环类化疗药物治疗优势人群，在高表达组中具有临床检测价值，对于低表达组应当使用Top2A FISH检测确证Top2A的基因改变。Top2A的基因异常可能对蒽环类药物的使用，减少患者痛苦提高预测疗效具有重要意义。

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