五倍子酸对小鼠胃癌MFC和肝癌H22细胞增殖的抑制作用

王丽萍，曾宪旭，牛凤兰，石 卓

1)郑州大学基础医学院组织学与胚胎学教研室 郑州 450001

2)吉林大学基础医学院药理学教研室 长春 130021

3)郑州大学第三附属医院病理科 郑州 450052

4)吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室 长春 130021

近年来，通过无毒或毒性较低的植物制剂进行化学治疗已经成为治疗恶性肿瘤的方法之一[1]，许多天然来源的植物成分在生物系统和动物模型中已显示出具有化学预防和治疗的作用。五倍子酸(gallic acid，GA)是一种具有抗氧化活性的天然化合物[2]，广泛存在于植物中，最初作为抗氧化剂用于防止脂肪等食物腐败。药理研究[3]表明，GA不仅具有抗炎、抗菌、抗过敏的活性，且对多种肿瘤细胞具有抑制作用[4-6]。该实验以小鼠胃癌MFC细胞和肝癌H22细胞荷瘤小鼠为实验模型，观察GA对上述2种细胞生长的抑制作用，并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 MFC细胞和H22细胞瘤株引自吉林省肿瘤研究所，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液传代培养，待细胞生长到对数生长期时使用。GA由吉林大学公共卫生学院卫生毒理学教研室提供，用于体外实验时以二甲基亚砜(DMSO)溶解，用于体内实验时用5 g/L的羧甲基纤维素钠溶解。四甲基偶氮唑蓝(MTT)购自Sigma公司。胎牛血清购自杭州四季青生物公司，青霉素、链霉素和DMEM培养基购自Gibco公司。昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，由吉林大学动物中心提供。

1.2 GA体外对2种细胞生长抑制率的MTT法测定 将处于对数生长期的MFC及H22细胞调整密度为1×105mL－1，接种于96孔细胞培养板，24 h后，分别加入不同质量浓度的GA，使其终质量浓度分别为 100.000、50.000、25.000、12.500、6.250、3.125 mg/L，设在培养液中加入 DMSO为对照组。每组设3个复孔，置37℃、体积分数5%CO2饱和湿度的培养箱中培养48 h后，每孔加入5 g/L的MTT 溶液 20 μL，继续培养 4 h，每孔加入 150 μL DMSO，振荡10 min，于570 nm波长处测各孔的吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=[(1－A(给药孔)/A(对照孔)]×100%。

1.3 GA体外对2种细胞周期及凋亡的影响 取对数生长期的MFC及H22细胞接种于6孔板中，培养24 h，加入 GA，使其终质量浓度为 25.00、12.50和6.25 mg/L，并设在培养液中加入DMSO为对照组。培养48 h，收集细胞，离心，弃上清，用PBS离心洗涤2次，加入体积分数70%冷乙醇于4℃固定12 h，离心洗涤后加入 200 μL PI染液，50 μL RNA酶，4℃避光放置20～30 min，1500 r/min离心5 min。调整细胞浓度为(1～10)×10 mL－1，上流式细胞仪分析。

1.4 GA对荷瘤小鼠抑瘤率的影响 2种细胞的抑瘤实验相同。取50只昆明小鼠，用无菌生理盐水调整瘤细胞浓度为5×106mL－1，于小鼠右腋皮下接种MFC细胞悬液，每只0.2 mL，24 h后采用随机数字表法分5组，每组10只。GA高剂量组(GA 0.50 g/kg)，GA 中剂量组(GA 0.25 g/kg)，GA低剂量组(GA 0.20 g/kg)，环磷酰胺组(环磷酰胺30.00 mg/kg)，生理盐水组。实验组及生理盐水组经灌胃给药，1次/d;环磷酰胺组经腹腔给药，隔天1次;连续给药10 d。于给药结束次日颈椎脱臼处死全部动物，剥取瘤组织称量，计算抑瘤率。抑瘤率 =(1－实验组瘤质量/对照组瘤质量)×100%

1.5 统计学处理 采用SPSS 15.0进行分析。应用单因素方差分析及Dunnet t检验比较各组细胞增殖抑制率、细胞周期分布、荷瘤小鼠瘤质量及抑瘤率的差异，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 GA对 MFC及H22细胞的抑制作用 见表1。

表1 GA对MFC及H22细胞增殖的抑制作用 %

2.2 GA对MFC细胞周期、凋亡及H22细胞周期的影响 随GA质量浓度的增加，2组细胞均发生G1/G0期阻滞;随GA质量浓度的增加，MFC细胞的凋亡也逐渐增多，而H22细胞凋亡率无变化，见表2、3。

表2 GA对MFC细胞周期和凋亡的影响 %

表3 GA对H22细胞周期的影响 %

2.3 GA对荷瘤小鼠瘤质量及抑瘤率的影响 见表4。

表4 GA对荷瘤小鼠瘤质量及抑瘤率的影响

3 讨论

早在20世纪90年代，有学者[4-6]初步证实GA具有诱导细胞凋亡作用，后来人们又相继证实其在体外对多种肿瘤细胞具有抑制作用，并初步探讨了其作用机制。但这些研究大多致力于体外抗肿瘤活性及其机制的初步探讨。

作者以MFC和H22细胞作为实验材料，证实了GA具有体外抑制它们生长的作用，并且呈现良好的剂量-效应关系。GA对MFC和H22荷瘤小鼠肿瘤的生长表现出明显的抑制作用。作者的研究结果显示虽然在同等剂量下GA的抑瘤效应不如环磷酰胺，但GA与环磷酰胺相比有2个优点:一方面GA对肿瘤细胞具有选择性作用[7-8]，另一方面GA对整体动物的毒性低[9]。

多数肿瘤的发生不仅由于细胞增殖速度快，而且与细胞死亡速度有关。细胞凋亡参与了癌症的起始过程，并对癌的发生起负调控作用。细胞周期的控制是细胞增殖的主要调节机制，一些细胞毒性药物通过阻滞细胞周期，进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡[10]。作者观察了GA对MFC和H22细胞周期分布的影响，结果显示其可将MFC细胞阻滞于G0/G1期，诱导MFC细胞凋亡，提示GA对MFC细胞的抑制作用可能是通过对该细胞的G0/G1期周期阻滞作用和诱导凋亡作用实现的。GA可使H22细胞发生G0/G1期阻滞，但未见明显的凋亡增加，提示细胞周期阻滞是GA抑制H22细胞增殖的主要原因之一，但增殖抑制作用并非通过促进凋亡实现。

[1]吕喆，牛凤兰，郗艳丽，等.三羟基苯甲酸纯化物及其化合物对Jurkat细胞周期进程及凋亡的影响[J].吉林大学学报:医学版，2010，36(5):904

[2]Rasool Mk，Sabina EP，Samya SR，et al.Hepatoprotective and antioxidant effects of gallic acid in paracetamol-induced liver damage in mice[J].J Pharm Pharmacol，2010，62(5):638

[3]Hsu JD，Kao SH，Ou TT，et al.Gallic acid induces G2/M phase arrest of breast cancer cell MCF-7 through stabilization of p27Kip1attributed to disruption of p27Kip1/Skp2 complex[J].J Aqric Food Chem，2011，59(5):1996

[4]You BR，Moon HJ，Han YH，et al.Gallic acid inhibits the growth of HeLa cervical cancer apoptosis and/or necrosis[J].Food Chem Toxicol，2010，48(5):1334

[5]Giftson JS，Javanthi S，Nalini N.Chemopreventive efficacy of gallic acid，an antioxidant and anticarcinogenic polyphenol，against 1，2-dimethyl hydrazine induced rat colon carcinogenesis[J].Invest New Drugs，2010，28(3):251

[6]Ji BC，Hsu WH，Yang JS，et al.Gallic acid induces apoptosis via caspase-3 and mitochondrion-dependent pathways in vitro and suppresses lung xenograft tumor growth in vivo[J].J Aqric Food Chem，2009，57(16):7596

[7]Isuzugawa K，Ogihara Y，Inoue M.Different generation of inhibitors against gallic acid-induced apoptosis produces different sensitivity to gallic acid[J].Biol Pharm Bull，2001，24(3):249

[8]Isuzugawa K，Inoue M，Ogihara Y.Catalase contents in cells determine sensitivity to the apoptosis inducer gallic acid[J].Biol Pharm Bull，2001，24(9):1022

[9]Rajalakshmi K，Devaraj H，Niranjali Devaraj S.Assessment of the no-observed-adverse-effect level(NOAEL)of gallic acid in mice[J].Food Chem Toxicol，2001，39(9):919

[10]周执芬，周云，刘明月.紫杉醇联合替尼泊苷对胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响[J].郑州大学学报:医学版，2009，44(5):942