大剂量甲强龙对兔髋关节周围骨组织BMP-2表达的影响

张永乐，王义生，张世清，王 晓

1)河南大学淮河医院骨科 开封 475000

2)郑州大学第一附属医院骨科 郑州 450052

临床上激素性股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head，ONFH)多见，致残率高[1]。成人激素性ONFH行人工关节置换术的翻修率明显高于因其他原因的人工关节置换术。骨形态发生蛋白－2(bone morphogenetic protein 2，BMP－2)是一种相对分子质量约为30000的碱性降解糖蛋白，主要生物作用是募集间充质细胞，并诱导其向成骨细胞或成软骨细胞方向分化。作者观察了大剂量甲强龙(糖皮质激素)对兔髋臼、股骨头、股骨近端骨组织病理表现及BMP－2表达的影响，探讨激素性ONFH人工关节置换术后翻修率较高的原因。

1 材料与方法

1.1 实验分组 健康新西兰成年大白兔27只，雌雄不限，体质量2.7～3.1 kg，采用随机数字表法分为3组，每组9只。对照组(C组)每次臀部肌内注射3 mL生理盐水，1次/d;观察A、观察B组臀部肌内注射甲强龙80 mg/kg，1次/d，分别连用3和6 d。注射后第2、4、8周的第1天，每组均取3只兔处死，取双侧髋臼、股骨头、小转子高度水平约3 mm厚的股骨近端骨标本，观测以下指标。

1.2 骨组织病理学观察 骨标本中性甲醛液固定5 d，EDTA 液(pH7.2)脱钙，常规制片，HE 染色，进行病理学观察。同时在高倍视野下计数200个骨陷窝，计算其中空骨陷窝所占的百分比。

1.3 骨组织BMP-2蛋白检测 采用SABC法免疫组化染色进行BMP－2蛋白检测。阳性反应信号为棕黄色颗粒样着色。采用Image－Pro Plus 5.0对染色结果进行积分光密度(IA)测量。选择目标区域时，去除软骨外区域和复染细胞核。每张片子选择3个400倍视野，每个视野测量3次，取其均数，表示BMP－2的表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0进行数据处理。3组空胃陷窝计数及BMP－2表达水平的比较采用3×3析因设计的方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 3组病理学观察结果 对照组骨小梁排列规则整齐，致密饱满，骨细胞清晰可见，核较大、位于中央，髓腔增生活跃，造血细胞、血管丰富，3个时间点病理表现无明显变化。观察A、B组2周时股骨头和股骨近端可见皮质和骨小梁中空骨陷窝稍增多，髋臼骨变化不明显;4周时股骨头、股骨近端可见少量骨质和骨髓出现典型的坏死、溶解，破骨细胞和成骨细胞均少见，空骨陷窝进一步增多，骨小梁变细、紊乱，髋臼骨变化不明显;8周时股骨头、股骨近端破骨细胞和成骨细胞更少见，空骨陷窝十分多见，骨小梁稀疏，骨皮质较薄。髋臼部位3组各时间点空骨陷窝计数差异无统计学意义;随作用时间的延长，2个观察组股骨头、股骨近端空骨陷窝计数增加，观察B组增加更明显，见表1～3。

2.2 3组BMP-2蛋白的表达 对照组各时间点均可见骨组织大片褐色着色，颜色较深;观察组2周时与对照组情况大致相同或染色深度略有降低，而4、8周时骨组织染色强度和染色面积均逐渐减小，甚至个别标本中无染色区域(图1)。随作用时间的延长，观察组髋臼、股骨头及股骨近端BMP－2的表达较对照组明显降低，观察B组降低更明显，见表1～3。

图1 3组兔股骨头骨组织BMP-2的表达(SABC，×400)

表1 髋臼空骨陷窝计数及BMP-2的表达(n=3)

表2 股骨头空骨陷窝计数及BMP-2的表达(n=3)

表3 股骨近端空骨陷窝计数及BMP-2的表达(n=3)

3 讨论

ONFH的发病机制一直是学术界争论的焦点，目前尚无定论，主要有脂肪栓塞学说、骨内压学说及微血管损伤学说及血管内凝血学说等[2－4]。血液的高凝和(或)高纤溶状态可引起股骨头内微血管栓塞，髓内脂肪细胞体积增大、堆积，骨内压增高，压迫髓内微血管，加剧股骨头缺血;同时髓内多能祖细胞活性下降，不能及时补充坏死的骨细胞和修复重建栓塞的微血管，最终导致股骨头的坏死甚至塌陷。激素性ONFH并不是由单一因素引起，而是多种因素综合作用的结果。糖皮质激素直接损害成骨细胞、骨细胞和破骨细胞功能，其最终结果是骨形成减少，骨吸收增多，机体对骨微损伤的修复能力下降，骨的脆性增加，导致容易发生病理性骨折，尤其易发生骨坏死。

该实验中，作者建立了激素性ONFH模型。病理学观察结果显示，模型兔股骨头骨细胞分布不均匀，排列紊乱，可见空骨陷窝;软骨下骨质局灶性破坏明显，骨组织结构紊乱，骨细胞分布不均匀，空骨陷窝增多;骨小梁连续性中断，结构紊乱。模型兔股骨近端髓腔内破骨细胞和成骨细胞少见，血管的数量和直径均降低，空骨陷窝十分多见，骨小梁断裂，骨皮质较薄。这种病理改变随激素用药时间的延长而愈加明显。但模型兔髋臼处成骨细胞和破骨细胞减少，骨小梁变细，空骨陷窝增加不明显。

BMP－2可上调66种基因表达，与多种细胞因子形成BMP－2信号通路，促进成骨细胞分化和骨细胞外基质的合成与分泌，多种细胞因子可通过调节BMP－2 信号通路影响骨代谢[5]。已有研究[6]证实，糖皮质激素可抑制BMP－2的表达，抑制程度与用药时间和用药剂量正相关。BMP－2含量减少，可直接造成成骨细胞成骨能力降低，骨质量下降。该实验中，作者观察到，模型兔髋臼、股骨头、股骨近端骨组织中BMP－2表达水平均降低，随激素用药时间的延长，这种变化更为明显。提示激素尤其是大剂量激素对BMP－2的表达有明显的抑制作用，从而直接影响到成骨能力的强弱，而这极有可能是造成激素性ONFH发生后股骨头骨形成、骨修复能力明显不足的重要原因[7]。所以作者认为，大剂量激素可造成髋臼、股骨近端及股骨头BMP－2表达降低，从而使成骨细胞成骨能力降低，骨质量下降;人工关节植入后，骨应变量减少，骨组织开始吸收并发生明显结构改变，导致假体松动。这可能是激素性ONFH人工关节置换术翻修率高的原因之一。

[1]李金山，林贺然.创伤性与激素性股骨头缺血性坏死全髋关节置换疗效比较[J].黑龙江医学，2002，26(8):573

[2]姜文学.2004年国家级股骨头坏死最新治疗进展专题研讨会会议纪要[J].实用骨科杂志，2005，11(2):190

[3]Kothapalli R，Ayaay JP，Bian H，et al.Ischaemic injury to femoral head induces apoptotic and oncotic cell death[J].Pathology，2007，39(2):241

[4]杨建平，王黎明，徐燕，等.单次低剂量脂多糖联合甲基强的松龙诱导股骨头坏死的实验研究[J].中国修复重建外科杂志，2008，22(3):271

[5]王霖霞，李玉坤.BMP－2信号通路与成骨细胞分化[J].国际骨科学杂志，2009，30(2):132

[6]赵继军，杨述华，许伟华，等.不同剂量激素对股骨近端的影响[J].中华实验外科杂志，2009，26(6):712

[7]王维军，牛东生.外源性激素致股骨头坏死VEGF与BMP－2 表达的研究[J].宁夏医学杂志，2009，31(2):102