灰飞虱体内Wolbachia的检测及三种稻飞虱Wolbachia的wsp基因差异分析

许存宾， 刘 艳， 王锡锋

（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193）

Wolbachia是一类细胞内共生菌，是属于α－变形菌门的立克次氏体。最早于1924年在尖音库蚊（Culex pipiens Linnaeus）的生殖器官内发现，命名为 Wolbachia pipienti［1］。Wolbachia 普遍寄生于昆虫、甲壳动物、螨虫和丝状线虫类动物体内，据估计66%的昆虫都感染有Wolbachia［2］。Wolbachia随母系遗传，参与调控寄主的诱导细胞质不亲和（cyto－plasmic incompatibility，CI）、雄性致死（male－killing）、雌性化（feminization）、孤雌生殖（parthenogenesis inducing）等多种生殖活动［3－7］，从而有利于自身的生存与传播，并影响寄主的生殖行为。此外也有研究表明Wolbachia能保护寄主抵御病原菌和寄生虫等的侵害［8］。Wolbachia还能依靠寄主的捕食、寄生等行为在昆虫的个体、群体间进行横向传播［9－10］。

早期的研究多用DAPI染色法和电镜观察昆虫体内的 Wolbachia［11－12］。随着分子生物学方法的快速发展，主要利用其16S／23SrDNA、groEL、ftsZ和wsp等基因进行PCR检测与序列分析［13］。编码表面蛋白的Wolbachia outer surface protein（wsp）基因是已知的Wolbachia基因中进化最快的基因，因而被广泛地用于Wolbachia的PCR检测与分子鉴别［14］。根据分子系统发生，Wolbachia的不同种属被划分为11个超群（supergroups A～K），节肢动物中的Wolbachia主要划分在A和B超群，并在两超群下又细分为12个组［14］。

水稻是我国最重要的粮食作物之一，水稻生产的丰歉直接影响我国的粮食安全。自20世纪60年代中期起，稻田3种飞虱（褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱）陆续成为影响我国水稻生产的重要生物灾害。同时灰飞虱还可以在水稻、小麦、玉米上传播水稻条纹病毒和水稻黑条矮缩病毒，引起的病毒病造成更为严重的损失［15］。长期以来国内外把研究重点放在与应急防治密切相关的技术研发上，而对与稻飞虱灾变和持续治理相关的生物学和生态学基础研究较少。特别是灰飞虱与内共生菌、病毒三者之间的相互关系的相关研究还未见报道。本研究的主要目的是检测我国主要水稻产区灰飞虱携带的共生细菌Wolbachia比例，对其wsp基因进行序列测定与比较，为深入研究稻飞虱与其体内共生物的关系，揭示Wolbachia对共生昆虫的作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫源材料

本试验所采用的灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallen）采集于我国12个省（自治区）21个水稻生产地区（见表1），采集时间为2010－2011年。田间活体采集并进行种类鉴定后，取部分样品按采集地区隔离饲养，剩余样品经液氮冷冻后－80℃冰箱保存备用。

1.2 DNA的提取

灰飞虱总DNA的提取采用Promega公司的Wizard Genomic DNA提取试剂盒，提取方法参考说明书略作改动。取冷冻保存单头灰飞虱经乙醇消毒清洗后，切取腹部组织于1.5mL离心管，加入液氮后用玻璃研棒充分研磨并加入50μL核酸裂解液（nuclei lysis solution）匀浆，直至组织完全破裂，再用100μL核酸裂解液冲洗研棒，混匀后65℃温浴20min。室温冷却，加入1μL RNase，37℃温浴20min，加入80μL蛋白质沉淀剂（protein precipi－tation solution），振荡混匀后冰浴5min，13 000～16 000r／min常温离心6min。取上清于1.5mL离心管中，加入300mL常温异丙醇，轻柔颠倒混匀，13 000～16 000r／min常温离心3min，弃上清，加入75%乙醇，13 000～16 000r／min常温离心2min，再加75%乙醇重复1次，超净台干燥后加入25μL ddH2O，65℃温浴溶解1h，－20℃保存备用。

1.3 PCR扩增

参照Zhou等方法［14］进行Wolbachia的wsp基因的PCR扩增，采取通用引物 wsp－81F：5′－TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC－3′；wsp－691R：5′－AAA AAT TAA ACG CTA CTC A－3′，引物由华大基因公司合成。扩增反应液（25μL体系）：模板DNA 1μL，10μmol／L正反向引物各0.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5Ur Taq 酶0.25μL，10×buffer 2.5μL，加ddH2O至25μL。在Eppendorf PCR仪中按下列扩增程序进行：95℃预变性5min；95℃变性0.5min，55℃复性0.5min，72℃延伸1min，36次循环；最后在72℃延伸10min；4℃下保存备用。

根据灰飞虱线粒体基因序列（GenBank登录号：FJ360695），设计引物COI－F：5′－ATT TAC CCA CCA CTA TCT－3′；COI－R：5′－TGG AAA TGA GCC ACT ACA－3′用于PCR扩增灰飞虱的COI基因，片段长度为752bp。扩增反应液（25μL体系）：模板DNA 1μL，10μmol／L正反向引物各0.5μL，2.5mmol／L dNTP 2μL，5Ur Taq 酶0.25μL，10×buffer 2.5μL，加ddH2O至25μL。在Eppendorf PCR仪中按下列扩增程序进行：94℃预变性3min；94℃变性1min，51℃复性0.5min；72℃延伸1min，36次循环；最后在72℃延伸10min，4℃下保存备用。

1.4 扩增产物的电泳检测

取PCR特异性扩增产物5μL，在1%的琼脂糖胶上进行电泳检测（电压100V，30min），紫外灯下观察结果并保存，明确Wolbachia的wsp基因与灰飞虱的COI基因是否存在以及扩增片段的大小。

1.5 Wolbachia的wsp基因片段克隆和测序分析

PCR产物纯化后，连接至pMD－18T载体上，转化到DH 5α大肠杆菌感受态中。每个样品选取3个阳性克隆由华大基因公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 DNA提取与PCR检测

对采集自全国12个省份（自治区）21个地区共167头灰飞虱样品进行Wolbachia测定，以灰飞虱COI为对照。其中16个地区的灰飞虱都100%感染有Wolbachia，5个地区出现非阳性个体，四川遂宁地区感染率最低，平均阳性率为96.41%（见表1）。

表1 不同地区灰飞虱感染Wolbachia情况统计表

2.2 序列测定与分析

对167头灰飞虱中的102头的Wolbachia wsp进行了序列测定，获得的wsp基因的序列长度均为599bp，各地理种群间序列仅存在极小的差异。21个地区群体中都具有相同的wsp序列个体，其中只有3个地区的个体中存在变异。云南大理（YNDL－1）样品的46位存在突变T→C；四川郫县（SCPX－2）样品的231位存在突变A→G，云南保山（YNBS－6）样品的584位存在一个gap。将全国大部分地区Wolbachia一样的wsp序列命名为National－wsp，参照Zhou等［11］Wolbachia的分类，结合NCBI的blast工具，用MEGA v.5对上述序列进行聚类构建系统进化树（图1）。

图1 灰飞虱体内Wolbachia的wsp基因的PCR产物电泳图

从系统发育树可以得出，灰飞虱体内Wolbachia在系统进化上属于B超群（supergroup B）内Con组（Group Con）［14］。在地理区域上，国内各地区以及日本、泰国等地的灰飞虱Wolbachia处于同一分支，不存在地理种群的分化。

图2 灰飞虱COI基因的PCR产物电泳图

2.3 三种稻飞虱体内Wolbachia的wsp序列分析

利用NCBI数据库，对比褐飞虱体内Wolbachia的wsp基因（GenBank登录号：GU289775，FJ713754，FJ713760，GU289751）序列和白背飞虱体内Wolbachia的wsp基因（GenBank登录号：GU361730，GU361731，GU361731，FJ713766）序列。其中白背飞虱与灰飞虱的序列完全一致，但两者与褐飞虱存在较大差异，序列相似性只有83.39%。由此我们假设白背飞虱与灰飞虱可能感染有相同的Wolbachia（图3所示，B超群下Con组），而褐飞虱可能感染另外一个株系的Wolbachia（图3所示，B超群下Cau组）。系统进化树中与灰飞虱和白背飞虱处于同一分支的还有寄生捻翅虫（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）、寄生螯蜂（Dryinid wasp），与之相近的还有一种寄生绒茧蜂［Cotesia glomerata（L.）］，这些寄生昆虫可能帮助了灰飞虱与白背飞虱体内Wolbachia在其种群内和种群间进行水平传播。但是3种稻飞虱在自然界具有密切交汇，那么三者体内应该携带相似的Wolbachia，然而三者中两者一样而另一种存在差异。

图3 灰飞虱体内Wolbachia与已报道的wsp基因构建系统发育树

3 讨论

通过设计Wolbachia的wsp基因的特异引物，对采集自我国12个省21个地区的灰飞虱进行鉴定，发现我国绝大部分地区灰飞虱都带有Wolbachia，且感染率高。不同地区灰飞虱Wolbachia的感染率存在一定的差异，四川地区的感染率较其他地方相对低，这与甘波谊等［16］的报道相一致。从群体分化来看，灰飞虱体内的Wolbachia为同一群体，不存在明显的地理种群分化，这可能与不同地区的灰飞虱群体可以经常进行基因交流有关。

三种稻飞虱体内的Wolbachia比较发现：灰飞虱与白背飞虱的wsp基因序列完全一致，而与褐飞虱存在较大差异。再次引起我们对Wolbachia如何在自然界进行传播的思考。有报道推测可能与灰飞虱和白背飞虱的寄生蜂（Dryinid wasp）、寄生捻翅虫（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）有关［10］，这两种寄生昆虫可能协助了Wolbachia在两种飞虱之间的水平传播。

三种稻飞虱在自然界具有极其相似的生活环境，寄生螯蜂（Dryinid wasp）和寄生捻翅虫（Elenchus japonicus Esaki ＆ Hashimoto）同为三种稻飞虱的寄生昆虫［16－17］，而从本研究得出的系统发育树可以明显看出Wolbachia在三者之间产生了种群分化。此外，从系统发育树中还发现与灰飞虱、白背飞虱处于同一分支的还有杂拟谷盗（Tribolium confusumJacquelin du Val），一种鞘翅目拟步行虫科昆虫。与褐飞虱处于同一分支的还有鳞翅目的赤松毛虫（Dendrolimus spectabilis Butler），寄生于赤松，与褐飞虱的生活习性及分布区域相差很大。怎样的遗传事件使不同的昆虫具有相类似的Wolbachia，而相类似的昆虫群体却具有不同的Wolbachia？当然，仅仅用wsp一个基因是不足以全面反映各宿主的Wolbachia种群的关系的，这只是一方面的推测。Wolbachia在自然界中真实的传播方式还需要从多方位、多角度进一步探索。

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