奶牛白细胞介素2基因的克隆及序列分析

盖仁华，平 丽，李广兴

（1.浙江大学药物安全评价研究中心，浙江杭州310058；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030）

白细胞介素2（interleukin 2，IL－2）是一种具有多种生物活性的细胞因子，研究表明［1］，IL－2是 T细胞在体外长期生长所必需的因子，也是TC细胞成熟因子，它可促进已活化的T细胞增殖、分化、成熟成为效应的TD细胞和TC细胞，诱导T细胞表面IL－2R的表达增加；可使B细胞活化、增殖，产生抗体；还可活化单核／巨噬细胞，并能够增强其杀瘤活性。在体内，IL－2是参与免疫应答的重要细胞因子，还可参与抗肿瘤及移植排斥反应［2］。

IL－2具有重要的生物学特性，可用于免疫治疗，协同治疗恶性肿瘤［3］及感染性疾病等［4－5］，目前IL－2在法国已。获准用于艾滋病的辅助性治疗［6］。本研究通过RT－PCR方法克隆了奶牛IL－2基因，并对其序列进行了分析，旨在为大量制备和生产高效价廉的奶牛IL－2，为在体外大量表达奶牛IL－2并获得重组蛋白积累资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 青年黑白花奶牛，来源于成高子奶牛养殖场。

1.1.2 菌种、质粒、工具酶和主要试剂 Trizol抽提试剂盒为Invitrogen公司产品，p MD18－T载体、DH5α、各种工具酶、反转录试剂盒及回收试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；淋巴细胞分离液为MP Biomedicals生物医学公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据GenBank上发表的奶牛IL－2基因序列（序列号：NM＿180997）使用Premier 6.0和 Oligo6.0设计一对特异性引物：P1：5′－CCCCGAATTCATGTCAGCAATGTACAAGATAC AACTCTTGTCTTGC－3′ ；P2：5′－GGGGCTCGAGT CAAGTCATTGTTGAGTAGATGC－3′。P1含Eco RⅠ酶切位点及起始密码子，从起始密码子起36个碱基均与GenBank上发表的奶牛IL－2基因序列同源。P2含XhoⅠ酶切点及终止密码子，引物序列与Gen－Bank上发表的奶牛IL－2基因序列的475位～498位互补，预期扩增目的片段大小为477 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 奶牛外周血淋巴细胞的分离与活化 根据于康震［7］的报导，用淋巴细胞分离液，从奶牛外周血中无菌分离淋巴细胞，用Hank′S液洗2遍。最后将淋巴细胞重悬于1640完全培养基中。计数并调整细胞浓度到107个／mL。Con A 浓度为7.5 μg／mL加入到24孔细胞培养板，置37℃、体积分数为5%的二氧化碳培养箱中培养24 h。

1.2.3 奶牛外周血淋巴细胞总RNA的提取 离心收集经Con A诱导培养的淋巴细胞，加Trizol并分装于1.5 mL的EP管中，按Trizol Reagent说明书提取奶牛外周血淋巴细胞总RNA。提取的奶牛外周血淋巴细胞总RNA于－80℃保存备用。

1.2.4 奶牛IL－2基因cDNA的合成 以提取的奶牛外周血淋巴细胞总RNA为模板，参照宝生物工程（大连）有限公司的反转录酶使用说明书合成cDNA。RT反应体系为10μL。在反应管中分别加入总RNA 模板1μL，10×RT缓冲1μL，MgCl22μL，特异下游引物0.5μL，d NTP混合物1μL，RNA酶抑制剂0.25μL，AMV反转录酶0.5μL，加灭菌超纯水至10μL，置42℃30 min，99℃5 min，4℃5 min，结束cDNA合成，进行PCR扩增。

1.2.5 奶牛IL－2基因的克隆及回收 PCR反应体系为50μL：在PCR反应管中加入cDNA模板10 μL，5×PCR缓冲液10μL，特异上、下游引物各0.5 μL，Ex Taq酶0.25μL，加灭菌超纯水至50μL，置PCR仪中进行PCR扩增。首先94℃预变性2 min，然后按以下条件进行反应：94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35个循环，72℃延伸10 min。用TaKa－Ra Gel DNA Fragment Recovery Kit Ver.2.0回收PCR产物。取5μL回收产物用琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.6 重组质粒的构建及鉴定 将纯化后的目的片段与p MD18－T载体16℃连接30 min，将连接产物与50μL JM109感受态细胞混匀后冰浴30 min，42℃水浴90 s，冰浴2 min，再加入890μL的SOC培养基，37℃摇床振荡培养60 min，最后取适量的培养物均匀涂布于含有60μg／mL Amp的LB平板上，37℃倒置培养12 h。随机挑取LB平板上生长良好的10个白色菌落，分别接种到含60μg／mL Amp的LB液体培养基上，37℃摇床振荡培养过夜，菌落PCR进行鉴定。用碱裂解法小量制备重组质粒DNA，取少量重组质粒DNA进行PCR鉴定，并用Eco RⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。

1.2.7 重组奶牛IL－2的序列测定 鉴定阳性的重组菌液，在宝生物工程（大连）有限公司的协助下，利用ABI PRISMTM377型自动测序仪，进行序列测定。

2 结果

2.1 纯化回收PCR产物鉴定

取纯化回收产物5μL，在10 g／L琼脂糖凝胶上电泳，结果显示，在500 bp略下方有特异性的条带，与预期结果相符（图1）。

2.3 重组质粒的鉴定

将重组质粒进行菌落PCR、双酶切和PCR鉴定，得到的片段与预期的片段大小一致（图2和图3）。

2.4 序列测定

测序结果显示，该基因序列有477个碱基。将所测得的序列与GenBank序列库中的序列号为NM－180997的奶牛IL－2基因序列进行比较后，与其同源性为98.7%，确定扩增到的序列是的IL－2基因序列。扩增到的序列与参考序列比较发现，第206位的C突变为T和304位的T突变为C。其中304位突变为无意义突变，编码的氨基酸没有变化。第206位的突变导致氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸（图4）。

2.5 基因序列比较与进化树的绘制

用DNASTAR软件，将所得的序列与GenBank中一些动物的IL－2序列进行比较，发现该序列与奶牛IL－2同源性为98.7%，与水奶牛IL－2同源性为95.3%，与山羊的同源性为在97.4%～97%之间，将该序列与GenBank中7种动物IL－2基因序列比较，绘制基因序列进化树（图5）。

图4 序列测定结果Fig.4 Sequencing results

图5 IL－2基因序列进化树Fig.5 IL－2 gene sequence phylogenetic tree

2.6 氨基酸序列的进化树

运用DNA Star软件，将奶牛IL－2推导的氨基酸序列与其他动物IL－2氨基酸序列比较，根据不同动物IL－2氨基酸序列差异，绘制IL－2氨基酸序列进化树（图6）。由图可见，IL－2氨基酸进化树大致可分成两部分，哺乳动物的IL－2大都在第一组，第二组包括小鼠和鸡。由进化树可看出，奶牛IL－2与水牛IL－2、山羊IL－2亲源关系很近。

2.7 各种动物IL－2的抗原性比较分析

运用DNAStar软件，比较不同动物IL－2的抗原性（图7）。奶牛IL－2与水牛、山羊的抗原性相当接近，特别在N端的10位～60位以及75位～140位氨基酸残基处图谱基本一致。而鸡IL－2的抗原性与奶牛、水牛及山羊的相差较远，尤其在35位～75位及95位～120位氨基酸残基处，差异显著。由图谱可见，所有比较的动物中，前20位氨基酸的抗原性相似性均较高，几乎没有抗原性，并且这些氨基酸残基大部分是疏水性的氨基酸，研究表明，这部分氨基酸残基构成了IL－2的信号肽。

图6 IL－2氨基酸进化树Fig.6 IL－2 amino acid phylogenetic tree

图7 不同动物IL－2抗原性的比较Fig.7 IL－2 antigenicity of different animals

3 讨论

从奶牛外周血淋巴细胞中提取的总RNA的质量直接影响RT－PCR扩增奶牛IL－2基因的数量。国内尚未有市售的奶牛淋巴细胞分离液，试验采用人淋巴细胞分离液对奶牛外周血淋巴细胞进行分离。奶牛外周血离心后，雾状的淋巴细胞层与红细胞层界面不清，分离效果不好。因此，在吸出白细胞过程中易吸入较多量的红细胞。此时，用适量的淋巴细胞分离液再次分离淋巴细胞，效果较好。

通过对多种动物的IL－2氨基酸序列的比较，发现各种动物IL－2中均包含一些十分保守的氨基酸序列。去除信号肽后，从N端起的7个氨基酸存在于所有已知的IL－2序列中。该保守序列同样存在于奶牛IL－2中。对不同动物IL－2序列进行比较时发现，人IL－2序列中58、105及125位的3个保守的半胱氨酸，亦存在于其它动物中，包括我们扩增的奶牛IL－2。奶牛与山羊有5个氨基酸的差异；奶牛与水牛有5个氨基酸差异，在这差异的位点上，氨基酸的种类发生了变化，但酸碱性与疏水性变化不大。由此，我们推测这三种动物的IL－2氨基酸序列差异很小，且空间结构上也十分相似。

IL－2具有种属特异性。IL－2的空间构象决定它能否与IL－2受体（IL－2R）结合，进而决定其种属特异性。Fassina G等［8］于1995年首次证实了IL－2Rα的结合位点位于15～27位氨基酸残基上，同年，Moreau J W 等［9］证实了N－端是IL－2Rβ的结合位点。我们比较了15～27位残基之间的7种氨基酸序列发现，奶牛、水牛及山羊的这部分氨基酸组成完全一致；奶牛与人及猴有两个相同位置氨基酸差异，第18位残基，奶牛是丙氨酸，而人和猴的是苏氨酸，第20位残基，奶牛的是甘氨酸，而人和猴的是丝氨酸；奶牛与鼠比较，鼠除了18位是苏氨酸和20位是丝氨酸外，第15位是苏氨酸，而奶牛的是丙氨酸。其余的10个氨基酸残基在奶牛、水牛、山羊等哺乳动物中完全一致。该部分奶牛与鸡只有5个氨基酸残基相同。不同动物IL－2的氨基酸组成有差异，亲源性越远的动物，差异越大。IL－2只有与IL－2R结合才能发挥其生物学活性。而与IL－2R结合的IL－2氨基酸序列可以影响生物学活性的种属特异性［10］。此外，IL－2的空间构型对于种属特异性方面也起着重要的决定作用。不同种属动物间，IL－2氨基酸的组成及空间结构上的差异，直接影响它与不同种属动物IL－2R的结合能力，最终表现为对不同动物生物学活性上的差别。

［1］Semenzato G.Tumor necrosis factor：a cytokines with multiple biological activities［J］.Br J Cancer，1990，61（3）：354－361.

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［5］Dubaniewicz A，Trzonkowski P，Dubaniewicz－Wybieralska M，et al.Mycobacterial heat shock protein－induced blood T lymphocytes subsets and cytokine pattern：Comparison of sar－coidosis with tuberculosis and healthy controls［J］.Respirology，2007，12（3）：346－354.

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［7］于康震，卢景良，谷守林.牛外周血T，B和单核细胞的分离、鉴定及扫描电镜观察［J］，中国兽医科技，1989，12（3）：5－7.

［8］Fassina G，Cassani G，Gnocchi P，et al.Inhibition of interleukin－22／p55 receptor subunit interaction by complementary peptides［J］.Arch Biochem Biophys，1995，318（1）：37－45.

［9］Moreau J W，Bossus M，de Groote D，et al，Characterization of a monoclonal antibody directed against the NH2 terminal area of interleukin－2 and inhibiting specifically the binding of IL－2 to IL－2 receptor beta chain［J］.Mol Immunol，1995，32（14）：1047－1056.

［10］Smith K A.Interleukin－2［J］.Curr Opin Immunol，1992，4（3）：271－276.