猪细小病毒体外培养适应毒株的培育及动物感染试验

李胜斌，危艳武，唐青海，吴洪丽，刘建波，郭龙军，王一平，刘 丹，刘长明

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室 猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨150001）

猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）可引发严重的繁殖障碍性疾病，初产母猪被感染后临床主要表现为不孕、流产、少产、死胎、木乃伊胎、畸形胎及弱仔等症状；仔猪和母猪被感染通常没有明显症状，但其体内很多组织器官均有病毒存在［1］。该病毒于1966年首次发现，1967年Cartwright F等［2］证明了其致病性。此后，许多养猪国家均有流行，猪群中病毒阳性检出率很高［1］。我国自20世纪80年代分离到PPV，流行病学调查证实猪群中该病毒的血清抗体阳性率达85%以上［3］。猪圆环病毒2型（PCV－2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原，该病于1991年在加拿大西部首次发现［4］，对全球养猪业造成了巨大的经济损失［5－7］。有研究表明，PPV与PCV－2的混合感染是导致PMWS的主要原因。Choi C等［8］在有PMWS病例中检测到了 PPV；Allan G M 等［9］通过 PCV－2与PPV共感染试验猪成功地复制出PMWS病症。由此可见，PPV与其他病原体协同感染的致病性应引起重视。

PPV属于细小病毒科（Parvoviridae），细小病毒属（Parvovirus），是一种自主复制型病毒，无囊膜，外观呈圆形或六角形，病毒粒子直径约21 nm，20面体等轴对称。实心的病毒粒子在CsCl中的浮密度为1.39 g／mL，空心的为1.30 g／mL［1］。该病毒的基因组为单股线性DNA，大小约5 kb［10］，分别编码3种结构蛋白（VP1、VP2、VP3）和3种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3）。鉴于我国临床上PPV与PCV－2混感情况十分普遍，两种病毒间的协同致病性尚不清楚，二联疫苗也未见报道。本研究在PCV－2疫苗研制成功的基础上，从临床流产病料中分离到一株病毒，经聚合酶链反应（PCR）、免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）、免疫电镜、核酸序列分析等方法，证实该分离毒株为PPV。此后经细胞连续传代，获得一株细胞培育适应毒株。本研究为开展PPV与PCV－2协同致病性研究及联苗的开发开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料 初产母猪流产胎儿的淋巴组织。

1.1.2 细胞 猪睾丸传代细胞系（ST）由国外引进，经PCR检测无PCV、PPV和支原体污染。

1.1.3 主要试剂 细胞培养液 MEM为清大天一公司产品；犊牛血清（FBS）为PAA公司产品；D－氨基葡萄糖为Sigma公司产品；提取总DNA所用酚－氯仿为上海生工生物工程技术服务有限公司产品；辣根过氧化物酶－葡萄球菌A蛋白标记物（HRPSPA）为Zymed公司产品；KOD－Plus高保真PCR扩增试剂盒为Toyobo公司产品；PPV阳性参考血清购自中国兽医药品监察所，猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和PCV－2阳性参考血清均由中国农科院哈尔滨兽医研究所相关课题组提供。

1.1.4 引物设计与合成 按GenBank登录的PPV参考序列 （NC001718，HM031134，GU978967，GU978965，EU790642，EU790641），采用 Oligo6.0软件设计PPV NS1基因的特异性引物序列。上游引 物 F129：5′－CATTGGCGTAAAAGAGGCGGGAA－3′，下游引物 R2679：5′－TGGTTGTTGAGATGTAGTTGGTGAG－3′，扩 增 的 目 的 片 段长度2 550 bp，引物合成由北京六合华大基因科技公司进行。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 取母猪流产胎儿的淋巴组织病料研磨成100 g／L乳剂，加入MEM细胞培养液稀释，加入等体积氯仿振荡处理10 min，经4 000 r／min离心30 min取上清，0.22μm微孔滤膜除菌，置－20℃保存备用。

1.2.2 细胞培养 采用无外源病毒和支原体污染的猪睾丸传代细胞系（ST）进行病毒分离，细胞培养液为MEM，添加50 mL／L灭活犊牛血清，青霉素、链霉素各100单位／mL，按常规方法进行细胞培养传代。

1.2.3 病毒传代 将处理的病料乳剂，按100 mL／L同步接种到新消化的ST细胞悬液中，置体积分数为5%的CO2培养箱中，37℃静置培养24 h，吸出上清液，更换无血清的MEM培养液继续培养96 h～120 h，收取病毒培养物反复冻融3次，以此为毒种同步接种ST细胞盲传3代。采用IPMA法测定病毒含量。

1.2.4 血清学鉴定 采用IPMA法检测感染细胞中的病毒抗原，包括PPV、CSFV、PRRSV、PCV－2、PRV和TGEV，具体程序按文献［11］进行。

1.2.5 病毒含量测定 取不同代次的病毒培养物，作10倍系列稀释，同步接种96孔细胞培养板培养的细胞，每个稀释度设4孔，同设不加病毒的健康细胞作对照，置体积分数为5%的CO2培养箱中，37℃静置培养，接种病毒72 h后固定细胞，采用IPMA法检测各孔细胞的病毒感染情况，按Reed－Muench法计算半数细胞感染量（TCID50／mL）。

1.2.6 D－氨基葡萄糖对病毒增殖的影响 取病毒感染细胞培养物，分别按100、50、20、10、5、1 mL／L比例同步接种新消化的ST细胞悬液，同时添加D－氨基葡萄糖组（10 g／L）与未添加组，置体积分数为5% 的CO2培养箱中，37℃静置培养24 h，吸出上清液，更换无血清的MEM培养液继续培养96 h，收取病毒培养物反复冻融3次。采用IPMA法测定病毒含量。

1.2.7 免疫电镜观察 取病毒感染细胞培养物，PBS洗涤细胞3次，预留0.5 mL PBS冻融3次，12 000 r／min离心20 min，取上清，加入终浓度为10 mL／L的PPV阳性血清，混合，4℃感作过夜，12 000 r／min离心20 min，其沉淀物用0.1 mL的PBS液溶解，20 g／L磷钨酸液（p H6.8）负染制样，电镜观察病毒免疫复合物。

1.2.8 病毒增殖动力学测定 取病毒培养物按10 mL／L的接毒剂量，接种于单层ST细胞，置体积分数为5%CO2培养箱内，37℃静置培养，于接毒后4、8、12、16、24、36、48、60、72、84、96、120 h 固 定 细胞，采用IPMA法检测各孔细胞的病毒感染情况。

1.2.9 病毒DNA提取和PCR扩增 按常规方法［11］提取病毒DNA作为PCR模板，采用KODPlus高保真PCR扩增试剂盒（Toyobo产品，杭州）进行DNA扩增。PCR扩增条件为：94℃2 min；94℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 5 min，35个循环；72℃10 min。PCR产物经10 g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.10 核苷酸序列测定 将扩增的PCR产物克隆至p GM－T载体（天根生化科技有限公司），取纯化的重组质粒送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，采用DNAMAN和MEGA 4软件进行序列分析与比对。

1.2.11 病毒回归动物试验 选用35日龄非免疫健康仔猪10头，经PPV抗体和抗原检测为阴性，取第50代病毒培养物（107.2TCID50／mL）经肌肉注射和滴鼻途径接种5头猪，每头肌肉注射1 mL，同时滴鼻1 mL，其余5头猪设为未接种对照组。试验猪隔离饲养，逐日观察临床反应，测定直肠温度，每周称量体重并采血。试验猪于攻毒后28 d处死，取心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、下颌淋巴结和小肠的组织病料做病理学观察，利用PCR法检测病毒核酸。

2 结果

2.1 毒株培育

分离的PPV－HJ毒株经ST细胞传至第10代，病毒感染细胞出现明显细胞病变（CPE），病变细胞呈现圆缩、变形和脱落，细胞内出现包涵体（图1B），未接种病毒对照细胞无明显变化（图1A）。病毒经细胞传25代后，其在细胞上的适应性显著增强，第40～50代增殖能力达到稳定状态。

2.2 血清学鉴定结果

取PPV－HJ株第50代培养物感染ST细胞，经固定后进行IPMA法检测，结果如图2。病毒感染细胞呈棕红色，且核区较深，病毒抗原主要集中在细胞核区，细胞质中也有分布。感染病毒细胞与其他几种病毒阳性参考血清（CSFV、PRRSV、PCV－2、PRV和TGEV）无交叉反应，表明不存在这些病毒污染。

2.3 免疫电镜观察结果

取第50代病毒培养物，进行免疫电镜观察，可见形态均一的病毒粒子与抗体结合形成的免疫复合物，单个病毒粒子直径约21 nm，未见有其他外源病毒粒子混入（图3）。

图3 PPV－HJ毒株免疫电镜观察Fig.3 Observation of PPV－HJ strain by immuno－electron microscope

2.4 传代毒病毒含量测定

PPV－HJ毒株经ST细胞传代，每5代取样测定病毒含量。该分离株在培养初期毒价较低，经细胞传代后毒价明显升高，尤以第40～50代，毒价稳定在107.2TCID50／mL，表明分离毒株已经适应体外细胞培养，能够保持良好的增殖性能。此外，我们验证了添加D－氨基葡萄糖对PPV－HJ株增殖的影响，添加组与未添加组毒价测定结果表明，该物质添加对病毒增殖具有明显的促进作用（图4）。

图4 添加D－氨基葡萄糖对PPV－HJ毒株毒价的影响Fig.4 Effect of D－glucosamine on the titers of PPV－HJ strain

2.5 病毒基因序列分析

从PPV－HJ毒株第50代培养物提取病毒核酸，以PPV NS1基因特异性引物扩增第129位～2 679位核苷酸序列，扩增结果见图5，片段大小与预期一致。核苷酸序列分析表明，该毒株的NS1基因序列与GenBank登录的PPV－ZJ毒株（EU790642）序列相似性最高，其相似性达98.41%。此外，PPV－HJ毒株NS1基因序列与GenBank下载的其他13株PPV 序 列：China 株 （AY583318）、SR－1 株（DQ675456）、NADL2 株 （NC＿001718）、Kress株（U44978）、YL 株 （JN860197）、Challenge 株（AY684866）、BQ 株 （EU790641）、PPV2010（JN 8 7 2 4 4 8）、N株 （HM 9 8 9 0 0 9）、VRI－1株（AY390557）、ZJ 株 （EU790642）、Nanjing 200801（FJ822038）和IDT 株（AY684872），绘制了 PPVNS1基因序列遗传进化树（图6）。在该遗传进化树中，IDT株（AY684872）单独形成一个进化分支。PPV－HJ株与中国的ZJ株（EU790642）和Nanjing 200801（FJ822038）处于同一个进化分支内（Group 1），其他毒株共同形成一个大的进化分支（Group 2）。

2.6 病毒增殖动力学测定

取PPV－HJ毒株第50代病毒接种细胞，对病毒感染细胞不同时间增殖动力学测定结果表明（图7），病毒接种后16 h能够检测到病毒感染阳性细胞，表明成熟的病毒粒子装配成功；24 h～36 h病毒感染阳性细胞逐渐扩散增多，表明子代病毒从细胞出芽释放；48 h～72 h病毒繁殖达到高峰，几乎所有细胞均被病毒感染；84 h～120 h，病毒感染细胞呈现圆缩、破碎、脱落，后期感染的阳性细胞仍可贴壁。

图7 PPV－HJ毒株感染ST细胞增殖规律的测定Fig.7 Determination of propagation rule of PPV－HJ strain in the ST cells

2.7 病毒回归动物试验

PPV－HJ毒株接种试验猪未见有明显的临床反应，也未出现发热症状；病毒接种后第7天可检测到病毒血症，持续到试验猪被处死。病毒接种后第14天可检测到血清抗体，持续到迫杀，但抗体效价较低（1∶50）。在试验过程中，未攻毒对照组试验猪无临床反应，PPV抗原与抗体检测均呈阴性结果。病毒接种28 d后处死试验猪，攻毒组猪各脏器未出现眼观可见病变，也未观察到明显的组织病理学变化。采用PCR方法对攻毒组猪的心、肝、脾、肺、肾、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、下颌淋巴结和小肠进行了病毒核酸检测。结果显示，攻毒组猪的肺脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、下颌淋巴结、小肠中病毒的检出率显著高于心、肝、脾、肾、肠系膜淋巴结的检出率，结果如表1所示。未攻毒对照组试验猪全部脏器均为PPV核酸阴性。

表1 PCR检测PPV－HJ病毒株人工感染试验猪组织中PPV核酸分布Table1 PCR test for the PPV nucleic acid distribution in organic samples from the experimentally infected pigs

3 讨论

本研究从临床病例中成功地分离到一株PPV，经过细胞传代培育成细胞适应毒株，命名为PPVHJ毒株。在病毒分离过程中，由于病料中存在多种病原，给PPV的分离带来了一定困难，本研究采用氯仿处理，将有囊膜的病毒去除，使之丧失对细胞的感染性，这样就可排除如CSFV、PRV等的干扰，有效地减少初代次病毒接种细胞时不良影响，提高病毒分离的成功率。有研究表明，PPV在ST细胞上的适应性和感染性最佳，且复制能力最强［12］。因此，本试验选择了ST细胞系对PPV－HJ毒株进行体外培养和传代。由于PPV的初代培养物感染ST细胞不出现细胞病变，所以检测病毒感染细胞中的抗原十分重要。本研究采用IPMA法检测病毒在感染细胞中抗原，可反映病毒在细胞培养中的增殖情况。研究表明，该方法具有操作简便，抗原定位准确，特异性强等优点，适用于病毒的定性和定量检测。随着PPV传代次数的递增，感染ST细胞开始出现CPE，同时病毒滴度也逐渐增加并趋于稳定。病毒增殖动力学表明，接种病毒后16 h能够检测到PPV感染阳性细胞，表明成熟的病毒粒子装配成功；24 h～36 h病毒感染阳性细胞逐渐扩散增多，表明子代病毒从细胞出芽释放；48 h～72 h病毒增殖达到高峰，几乎所有细胞均被病毒感染；84 h～120 h，病毒感染细胞呈现圆缩、破碎、脱落，后期感染的阳性细胞仍可贴壁。由于PPV粒子较小，常规电镜负染法观察不易确认，采用免疫电镜方法观察病毒免疫复合物，获得了满意的病毒形态学鉴定效果，观察到的PPV粒子大小及形态与文献报道基本一致［1］。

从病毒基因组序列分析结果看，PPV－HJ株的NS1基因与GenBank登录的PPV－ZJ毒株（EU790642）的NS1基因相似性最高，基于PPVNS1基因构建的系统发育树上，PPV－HJ株与中国的ZJ株（EU790642）和 Nanjing 200801（FJ822038）共同处于同一个较大的进化分支内，这一结果表明，PPV－HJ株很可能是由中国本地的PPV毒株经过自然选择演化而来的。有报道证实，PPV在多数细胞处于旺盛的有丝分裂期接种病毒最佳，这个时期许多细胞处于S期，即DNA合成期，细胞中的DNA聚合酶能够促进病毒复制［1］。因此，本试验采用病毒同步接种细胞进行传代，目的在于使病毒复制能够有效利用宿主细胞的酶类。Tischer I等［13］通过对PCV培养特征发现，D－氨基葡萄糖处理可显著增强病毒的增殖能力，这可能是由于该物质能够提高宿主细胞S期合成的DNA聚合酶量，或延长该聚合酶合成时间，其机制尚未阐明。本研究对PPV－HJ毒株感染的细胞中添加10 g／L的D－氨基葡萄糖，从结果看，处理后能够显著提升子代病毒滴度，表明该物质可促进PPV的增殖。

动物感染试验表明，该毒株接种试验猪，其体温保持正常，未表现明显的临床症状，这与先前报道基本一致［9，14］。该毒株接种后第7天能检测到病毒血症，第14天检测到血清抗体，病理学观察表明，感染猪脏器未观察到明显的病理变化，然而，采用PCR法在多种脏器中均检出有本病毒核酸存在，证明本试验培育的PPV－HJ毒株对易感动物仍具有感染性。国外相关报道证明，PCV－2与PPV混合感染可引起猪产生典型的 PMWS症状［9，14－15］，PPV 单独感染能够引起严重的繁殖障碍性疾病，给养猪业造成了巨大的损失。为此，本研究获得的PPV毒株，为今后开展PPV与PCV－2共感染的致病机理的研究，以及联合疫苗的研制奠定了基础。

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