伪狂犬病病毒HB－98株不同保存条件下病毒含量的比较

张苗苗，王 丹

（1.湖北生物科技职业学院动物科学系，湖北武汉430070；2.武汉科前动物生物制品有限责任公司，湖北武汉430070）

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是由伪狂犬病病毒引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者，常造成暴发性流行，妊娠母猪表现为流产、死胎、木乃伊，常以产死胎为主。新生仔猪感染后，可引起大量死亡，15日龄以内死亡率很高，可达100%，3周龄～4周龄仔猪的发病率高达40%～60%，育肥猪感染本病毒后可引起轻微的发热，呼吸道症状和生长迟缓，后备及空怀母猪感染病毒后可引起不育症，不发情、返情、屡配不孕等。公猪表现为睾丸肿胀、萎缩、失去种用能力。该病具有高度传染性，易在猪群间不断传播，给养猪业造成巨大的经济损失。因无有效药物用于伪狂犬病的防控，对其控制主要依赖于疫苗免疫接种。而疫苗的效价（病毒含量）是始终困扰生产企业的问题，病毒含量的高低决定了疫苗质量的优劣，影响病毒含量高低的因素有很多，其中温度是一个不能忽视的重要因素。本研究通过对相同条件下生产的同一批次的伪狂犬病病毒HB－98株的病毒液抗原和冻干成品在不同温度下保存的病毒含量进行追踪测定，进一步了解该病毒的部分生物学特性，为实际生产应用提供一些数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、病毒 猪肾传代细胞（IBRS－2），购自武汉中国典型培养物保藏中心；原代鸡胚成纤维细胞（CEF），由武汉科前生物制品有限公司实验室制备。

伪狂犬病病毒TK－／gG－／LacZ＋突变株 HB－98株毒种，由华中农业大学动物病毒室构建；伪狂犬病病毒HB－98株病毒液和猪伪狂犬病活疫苗（HB－98株）成品，由武汉科前动物生物制品有限责任公司提供。

1.1.2 试剂和溶液 DMEM培养基购自GIBCO BRL公司，置2℃～8℃保存。

DMEM培养液：取DMEM 粉末13.5 g溶于950 mL双蒸水中轻轻搅拌至完全溶解后加入3.7 g Na HCO3，用1.0 mol／L HCl调p H 至6.8～7.0，定容至1 000 mL，过滤除菌，置4℃保存备用。

细胞生长维持液：在DMEM培养液中加入20 mL／L的新生牛血清，100单位／mL的青霉素，100 μg／mL的链霉素，4℃保存备用。

新生牛血清，购自杭州四季青生物工程材料有限公司，置－20℃以下保存备用。

1.2 方法

1.2.1 保存期试验 将经过无菌检验合格的猪伪狂犬病病毒HB－98株病毒液抗原分装于无菌小瓶，分别存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、3、7、14、21、28 d，以后每隔1周取出测定病毒含量；将经无菌检验、真空度测定合格的猪伪狂犬病活疫苗HB－98株冻干成品分别存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、7、28 d，以后每隔1月取出测定病毒含量。

1.2.2 病毒组织培养半数感染（TCID50）测定 将待测病毒（冻干成品先用DMEM维持液恢复至原量）用DMEM维持液按10倍系列稀释，即10－1、10－2、至10－10等。将100μL不同稀释度的病毒液加入96孔培养板中，每个稀释度8孔，然后加入消化分散的IBRS－2细胞悬液，稍微振荡，然后置37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每日观察2次，逐日记录细胞病变孔数，按Reed－Muench法计算TCID50。

Reed－Muench法的计算：先计算出各稀释度的病毒液引起病变和非病变的累积细胞孔数，按下述公式计算出距离比例。

距离比例＝（高于50%病变率的百分数－50%）／（高于50%病变率的百分数－低于50%病变率的百分数）。

lg TCID50＝高于50%病变率的稀释度的对数＋距离比例×稀释倍数的对数

2 结果

2.1 伪狂犬病毒HB－98株病毒液的保存期试验结果

将伪狂犬病毒HB－98株病毒液分装于无菌小瓶，分别存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、3、7、14、21、28 d，以后每隔1周取出测定病毒含量，结果见表1。

表1 伪狂犬病毒HB－98株病毒液的保存期试验（TCID50）Table1 The storage test of pseudo rabies virus HB－98 strain virus liquid（TCID50）

一般情况下，伪狂犬病病毒HB－9株病毒液毒价低于7.05效果会受到一定的影响，保存期试验表明，在2℃～8℃至少可存放3个月。但在－20℃以下存放病毒含量下降较快，故在实际生产过程中病毒液的存放宜于2℃～8℃存放为宜，但为了保证效果，也宜控制在3个月以内。

2.2 猪伪狂犬病活疫苗HB－98株成品的保存期试验

经无菌检验、真空度测定合格的猪伪狂犬病活疫苗HB－98株成品分别存放于2℃～8℃和－20℃以下，于0、7、28 d，以后每隔1月取出测定病毒含量，结果见表2。

表2 猪伪狂犬病活疫苗HB－98株成品的保存期试验（TCID50）Table2 The storage test of pseudo rabies virus HB－98 product（TCID50）

一般情况下，伪狂犬病毒HB－9株病毒液毒价低于6.6效果会受到一定的影响，保存期试验表明，猪伪狂犬病活疫苗HB－98株成品在－20℃以下至少可存放18个月，病毒含量无明显差异，但在2℃～8℃存放，随着时间推移，病毒含量稍有下降，故在实际生产应用中应以－20℃以下存放为宜。

从表1和表2结果表明，在不同保存条件下不同时间病毒液的质量是不一样的。病毒液在－20℃以下保存一段时间病毒含量下降较快，而在2℃～8℃存放病毒含量下降相对较慢，故在实际抗原生产过程中宜采用2℃～8℃保存伪狂犬病抗原，特别是进行抗原储备时尽量避免抗原反复冻融。而对于冻干后的成品疫苗，在保存期内还是尽可能采用－20℃以下保存。

3 讨论

病毒含量是衡量一个疫苗产品质量的一个非常重要的指标，病毒含量的高低往往决定了疫苗效价的高低，也就决定了疫苗的质量。在实际生产、运输、储存、使用过程中影响抗原或疫苗病毒含量的因素很多，温度是最重要的一个因素。在抗原生产过程中，由于生产检验需要一定的周期，生产出的病毒液抗原不可能立即投入到下道工序，必须经过一定时间的储存；另外，不同厂家可能由于产能的限制，需要进行一定数量的抗原储备，故需要对抗原进行一段时间的存放，这就必须要求合格的抗原在经过一定时间的存放后依然保持较高的病毒含量。本研究表明，病毒液抗原在2℃～8℃保存其病毒含量下降的要慢些。但在本研究过程中还发现，在风冷冷库中保存一段时间后抗原病毒含量下降较快，而相同的病毒液抗原在同一温度冰柜中保存则病毒含量下降相对较慢。分析原因可能是风冷冷库有自动化霜时间，在化霜时冷库温度是要上升的，这样抗原温度也随之升高，这就相当于将抗原进行反复冻融，因此保存一定时间后其病毒含量下降很多。因此，在我们实际生产过程中，应尽量将抗原放置在温度相对恒定的容器中保存，或在很短时间内将其用完，尽量避免长期储存。对于进入运输使用过程中的成品疫苗，在生产厂家由于其自身的硬件环境及管理措施比较到位，冷库的温度一般来讲不会出现问题，但在实际短途运输过程中，特别是在基层农户使用过程中，往往由于受实际情况的约束，不可能始终保证理想的保存温度，本试验证明，短时运输也不会影响成品质量，但也要尽量避免在高温下暴露，这样才能保证疫苗的质量。

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