日本血吸虫p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗免疫对小鼠肝脏虫卵肉芽肿形成的影响＊

彭 微，汪世平，郑长黎，宋海鹏，刘 怀

业已证明，疫苗是人们控制传染性疾病传播的最为经济有效的措施之一。近几年来，中南大学湘雅血吸虫病研究室先后构建了几种抗日本血吸虫病天然分子疫苗编码基因相关的核酸疫苗，其中包括编码SIEA26－28 k Da分子抗原的p VAX1／Sj RPS4，以及编码Sj31／32k Da分子抗原的p VAX1／Sj CB等。在此基础上，本研究将已经构建成功的p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗免疫小鼠，进一步观察疫苗免疫后对小鼠肝脏虫卵肉芽肿的病理形态学改变及周长和面积的影响，从而为该疫苗的免疫保护力研究提供有意义的形态学资料。

1 材料与方法

1．1 实验动物 阳性钉螺系中南大学湘雅血吸虫病研究室提供，从人工毛蚴感染钉螺后筛选获得；清洁级昆明小鼠，雌性，体重25～30 g，由湘雅中南大学实验动物学部提供。

1．2 质粒 p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／Sj CB、p VAX1／Sj RPS4·CB由湘雅血吸虫病研究室构建并保存。

1．3 动物分组及实验方案 55只昆明小鼠随机分成5组：PBS对照组、p VAX1空质粒组、p VAX1／Sj RPS4单价疫苗组、p VAX1／Sj CB单价疫苗组、p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗组。每组注射相应质粒100μg或等量PBS，注射部位为左后腿股四头肌。每隔2周加强免疫1次，共3次。末次免疫后2周经腹部皮肤攻击感染20±1条日本血吸虫尾蚴，感染后第6周处死小鼠。

1．4 肝组织石蜡切片及HE染色 随机自各组取5只小鼠剖杀，肝组织经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋，制成石蜡组织块，制成10μm的连续切片，按常规方法进行HE染色。

1．5 虫卵肉芽肿周长和面积的测量 采用UVP成像系统，在100×视野下，每组选取15个肉芽肿，测量肉芽肿的面积和周长，测量数据采用方差分析检验。数据采用均数±标准差（x±s）表示，并用SPSS10．0统计软件处理。

2 结 果

2．1 小鼠肝脏组织病理学变化 肝组织切片镜下显示，PBS对照组肝组织中肝细胞变性、坏死，可见大量的虫卵肉芽肿形成，肉芽肿体积较大，肉芽肿内有多个虫卵聚集，周围有大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和浆细胞浸润，虫卵周围可见到少量梭形的成纤维细胞及类上皮细胞（图1）。p VAX1空质粒组也可见大量肉芽肿，周围有大量淋巴细胞、巨噬细胞浸润，但是肝细胞变性坏死程度较PBS对照组轻（图1）。p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／Sj CB组疫苗免疫，尾蚴攻击后肝脏病变大致相同，其病变明显减轻，小鼠肝细胞混浊肿胀，汇管区虫卵肉芽肿数量减少，体积减小，炎性细胞浸润主要以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞为主，可见少量巨噬细胞和浆细胞（图1）。p VAX1／Sj RPS4·CB病变程度最轻，肝小叶结构完整，虫卵肉芽肿周围炎症反应轻，细胞浸润不明显，肉芽肿面积较小（图1）。

2．2 对虫卵肉芽肿形成影响的观察 对肝脏虫卵肉芽肿测量发现，疫苗免疫、尾蚴攻击后，疫苗组的肉芽肿平均周长分别与p VAX1空质粒组、PBS对照组相比，均数经统计学检验差异有统计学意义（F＝6705．41，P＜0．05）；其肉芽肿平均面积分别与p VAX1空质粒组、PBS对照组相比，均数经统计学检验差异有统计学意义（F＝2 901．28，P＜0．05）。两组单价疫苗组和多价疫苗组相比，虫卵肉芽肿的平均面积和周长也有统计学意义（P＜0．05），见表1。

表1 疫苗免疫、尾蚴攻击后小鼠肝脏虫卵肉芽肿测量结果Tab．1 Results of egg granulomas measurement after the vaccine i mmunized mice challenged by Sj cercariae

3 讨 论

图1 肝脏虫卵肉芽肿HE染色（×100）A ：p VAX1组 （HE染色×100）；B：PBS组（HE染色×100）；C：p VAX1／Sj RPS4组（HE染色×100）；D：p VAX1／Sj CB组（HE染色×100）；E：p VAX1／Sj RPS4·CB组（HE染色×100）Fig．1 Liver egg granulomas（HE staining，×100）A：p VAX1 group；B：PBS group；C：p VAX1／Sj RPS4 group；D：p VAX1／Sj CB gr oup；E：p VAX1／Sj RPS4·CB gr oup

血吸虫病的主要病变是虫卵引起肝脏和肠壁组织发生虫卵肉芽肿和组织纤维化。因此，肝组织的病理学改变可以直接反映疫苗的抗病效果。包括虫卵结节的数目、大小、肝脏组织病理变化等。段义农等［1］研究发现经SEA处理的小鼠感染血吸虫后，肝脏中虫卵肉芽肿的直径小于对照组。李文桂等［2］研究显示用BCG－Sj 26GST疫苗接种小鼠后肝脏肉芽肿数目少，体积小，平均周长和平均面积小于对照组。应用重组Sj26 GST（reSjc GST）抗原免疫小鼠，可诱导产生18．2%～30．5%的减虫率和21．7%～59%的减卵率，同时肝脏虫卵肉芽肿明显变小［3］。Mah moud H Ro meih 等［4］对埃及曼氏血吸虫疫苗研究中发现免疫组较对照组肉芽肿结节数减少，体积减小。嗜酸性粒细胞减少明显。万中原等［5］从日本血吸虫成虫分离纯化出天然28、31／32和97 k D蛋白，混合成多价疫苗免疫小鼠，获得较高的减虫率和肝减卵率，而且研究发现疫苗具有一定的抑制虫卵肉芽肿的作用。秦永华等［6］发现日本血吸虫p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗免疫昆明小鼠，尾蚴攻击感染后减虫率为25．2%～31．3%，每雌减卵率为24．1%～31．5%，每克肝减卵率为44．9%～58．8%，提示该疫苗可产生较好的保护性免疫反应。本研究在此基础上对p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗组免疫小鼠后的组织切片进行观察，结果显示，肝脏病变程度较轻，虫卵数量较少，肝小叶结构较完整，炎症细胞浸润少。随后，测量其肝脏虫卵肉芽肿的周长和面积，同样发现肉芽肿的平均面积和周长有明显减小，具有显著的统计学意义（P＜0．05），表明p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗组具有明显的抑制虫卵肉芽肿的效果，虫卵结节明显减小。

多价DNA疫苗是将不同抗原分子序列的碱基通过一定的方式连接在一起，共同插入到同一真核载体内，并在宿主体内共表达。石佑恩等［7］用RTPCR从成虫体内扩增Sj GST，构建大肠杆菌－分支杆菌穿梭表达质粒PBCG－Sj 26 I－IV，再将其依次转化到大肠杆菌、耻垢分枝杆菌中，筛选出重组耻垢分枝杆菌疫苗和重组BCG多价疫苗，用以免疫小鼠，获得27．36%减虫率和60．50%的肝卵减少率。

张冉等［8］发现多价疫苗 VR1012－Sj GST－Sj 31和VR1012－Sj GST－Sj 32均能诱导小鼠产生一定水平的抗血吸虫感染保护作用，其免疫效果大于单价疫苗。

以 多 价 DNA 疫 苗 p BK－Sj 26－Sj 23 和 p BKSj 23－Sj 23免疫小鼠能产生特异性免疫应答。减虫率为28．12%和28．50%，与单价疫苗比较有所提高。［9］

王晓婷［10］的研究中同样也发现 pc DNA3．1－TPI－linker－（CDR3）6多价DNA 疫苗减虫率和减卵率均显著高于单价DNA疫苗组。证明多价DNA联合疫苗中的各单价分子发挥协同作用，比单价DNA疫苗抗感染力有了明显提高，对宿主的保护力显著增强［11］。从而解决了单价DNA疫苗免疫力保护力低的问题。本研究p VAX1／Sj RPS4·CB多价疫苗组和p VAX1／Sj RPS4、p VAX1／CB单价疫苗组相比，肝脏组织切片病变程度更轻，肝脏虫卵肉芽肿周长和面积有明显减小，提示多价疫苗比单价疫苗抑制虫卵肉芽肿的作用更好，可以产生比单价疫苗更优的免疫保护效果。

总之，基因重组DNA联合疫苗具有增强免疫保护力，减少免疫次数，操作简单，节约成本等特点。而且，不存在鸡尾酒式混合疫苗中可能增加的毒素问题，具有广泛的研究前景和开发价值。p VAX1载体是通过pc DNA3．1改良而新开发的被美国药品及食品鉴定委员会验证批准的用于疫苗临床使用的真核表达载体。本实验采用它作为多价疫苗的载体，为日本血吸虫疫苗今后在临床的应用提供了一定的依据和基础。

［1］Duan YN，Li R，Zhou Q，etal．Effects of i mmuno－tolerance of the for mation Schistoso ma j aponicu m egg granulo ma in mice［J］．Chin J Parasit Dis Contr，2001，14（4）：294－296．（in Chinese）段义农，李荣，周全，等．免疫耐受对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响［J］．中国寄生虫病防治杂志，2001，14（4）：294－296．

［2］Li WG，Shi YE，Chen Y，etal．Pat hological changes of the liver of BALB／c mice i mmunized wit h reco mbinant BCG－SJ26 GST vaccine of Schistoso me［J］．Chin J Parasit Dis Contr，2000，13（2）：139－141．（in Chinese）李文桂，石佑恩，陈焰，等．血吸虫重组BCG－Sj26 GST疫苗接种BALB／c鼠后肝脏病理学变化［J］．中国寄生虫病防治杂志，2000，13（2）：139－141

［3］Li LZ，Shi YE，Jiang K，etal．Immune effect induced by S．j aponicu m DNA vaccine wit h different vectors in mice［J］．Huazhong Univ Sci Tech Healt h Sci，2003，32 （1）：325－618．DOI：cnki：ISSN：0258－2090．0．2003－01－001

［4］Ro meih MH，Hassan H M，Shousha TS，etal．Immunization against Egyptian Schistoso ma mansoni infection by multivalent DNA vaccine［J］．Acta Biochi m Biophys Sin，2008，40（4）：327－338．DOI：10．1093／abbs／g mp062

［5］Wan ZY，Li YL，Han JJ，etal．St udy on the pr otection of multivalent molecular vaccine of Schistosoma j aponicu m against ex－peri mental infection wit h Schistosoma j aponicu m in mice［J］．Chin J Parasit Dis Contr，1998，21（1）：16－18．（in Chinese）万中原，李雍龙，韩家俊，等．日本血吸虫多价分子疫苗的保护性免疫力研究［J］．中国寄生虫病防治杂志，1998，21（1）：16－18．

［6］Qin YF．Studies on the bivalent vaccine p VAX1／Sj RPS4·CB－the target gene relevant to the nat ural molecule and cocktail vaccines against Schistoso ma j aponicu m［D］．Changsha：Central Sout h U－niversity，2008：30－31．（in Chinese）秦永华．抗日本血吸虫病天然分子靶基因p VX1／Sj RPS4·CB双价疫苗与联合 免疫的研究［D］．长沙：中南大学硕士论文，2008：30－31．

［7］Shi YE ，Han JJ，Li WG ，etal．Study on BCG genetic engineering multivalent vaccine of Schistoso ma j aponicu m ［J］．Chin J Parasit Dis Contr，1998，10：27－33．（in Chinese）石佑恩，韩家俊，李文桂，等．日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究［J］．中国血吸虫病防治杂志，1998，10：27－33．

［8］Zhang R，Yi XY，Zeng XF，etal．DNA vaccine of VR1012－SJGST－SJ31 and VR1012－SJGST－SJ32 against Schistosoma j aponicu m：expression and protective i mmunity in mice［J］．Chin J Schisto Contr，2004，16（1）：27－31．（in Chinese）张冉，易新元，曾宪芳，等．日本血吸虫二价DNA疫苗的免疫保护效果的研究［J］．中国血吸虫病防治杂志，2004，16（1）：27－31．

［9］Li LZ，Shi YE，Jiang K，etal．St udy on the i mmune effect of multiantigenic DNA vaccine p BK－Sj 26（Sj32）－Sj 23 of Schistosoma j aponicu m［J］．Acta Univ Med Tongji，2001，30（5）：404－406．（in Chinese）李柳哲，石佑恩，江侃，等．日本血吸虫多价DNA疫苗p BK－Sj26（Sj32）－Sj23免疫效果观察［J］．同济医科大学学报，2001，30（5）：404－406．

［10］Wang XT，Zhu YC，Guan XH，etal．Constr uction of multivalent DNA vaccine of Schistosoma j aponicu m and its identification［J］．Chin J Schisto Contr，2005，14（3）：84－87．（in Chinese）王晓婷，朱荫昌，管晓虹，等．日本血吸虫多价DNA疫苗的构建及鉴定［J］．中国血吸虫病防治杂志，2005，14（3）：84－87．

［11］Feng QM，Zhang SJ，Wang SP．Reaserch pr ogress on co mbined i mmunization of DNA vaccine against Schistoso ma j aponicu m［J］．Chin J Zoonoses，2012，28（7）：728－734．（in Chinese）冯其梅，张树菊，汪世平．日本血吸虫DNA疫苗联合免疫的研究进展［J］．中国人兽共患病学报，2012，28（7）：728－734．