结核分枝杆菌CFP－10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究＊

朱中元，张 丹，王海波，肖劲逐，邱一帆，颜 磊，陈 德，刘爱国，杨 欣

结核病是当今世界上由单一致病菌感染引起的死亡率最高的疾病，严重威胁着人类的健康。全世界大约有三分之一的人感染了结核菌，并且感染人数在以每年700万～800万的速度增加。因此，结核病快速准确的早期诊断成为控制结核病流行的重要手段之一。目前我国结核病诊断主要由临床表现、影像学诊断结合痰涂片镜检、细菌培养或PPD皮试进行。但是由于常规细菌学检查方法的灵敏性差，而且细菌培养费时长（6～8周），以及受人为操作影响等原因，这些方法对于结核病快速的帮助有限［1］。ELISA方法测定结核菌抗体水平具有简单、低廉、快速的特点，作为结核病的辅助诊断方法之一，正逐渐被众多研究者所重视。结核菌分泌许多蛋白到细胞外，在结核病人的免疫反应发挥了很重要的作用。研究表明CFP－10是T细胞的靶抗原，能诱导皮肤迟发型超敏反应并刺激外周血单核细胞产生特异性IFN－γ［2］。Rv2626c抗原是 MTB休眠期特异表达的蛋白之一，有较强的抗原性，可激发宿主机体产生较高的抗体水平［3］。本实验通过构建结核菌CFP－10、Rv2626c蛋白表达载体，在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达，并对表达产物进行纯化，以获得大量CFP－10抗原、Rv2626c抗原，同时将重组的CFP－10、Rv2626c蛋白组成联合抗原进行ELISA实验，为探索重组蛋白在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。

1 材料和方法

1．1 菌种和载体 结核菌H37 Rv、大肠杆菌BL21（DE3）、表达载体p ET－30a均为海南省农垦总医院保存。

1．2 试剂 β－硫代半乳糖苷（IPTG）、硫酸卡那霉素（Kan）购自上海生工生物工程技术服务有限公司。DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶和DNA Mar ker购自宝生物（大连）有限公司。预染蛋白Mar ker购自北京百泰克生物技术有限公司。普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京天根生物科技有限公 司。6×His－tagged Ni－NTA Agar ose蛋白纯化柱是QIAGEN公司产品。常用高纯度生化试剂均为Biosharp公司产品，其他试剂均为国产分析纯试剂。HRP标记抗人Ig购自Solar bio公司。显色底物购自英科新创科技有限公司。

1．3 血清来源 118份肺结核患者血清由海口市结核病防治所提供，其中痰涂阳性患者血清20份，痰涂阴性患者血清98份；96份健康查体者血清由海南省农垦总医院提供。

1．4 引物 根据Gen Bank中结核菌标准株H37 Rv的CFP－10、Rv2626c基因序列，设计 CFP－10基 因5′端 引 物 为 Ⅰ：5′－CCGGAATTCATGGCAGAGATGAAGACCGAT－3′，3′端 引 物 为 Ⅱ：5′－CCCAAGCTTTCAGAAGCCCATTTGCGAGGAC－3′。Ⅰ、Ⅱ的酶切位点分别为Eco RⅠ和Hin dⅢ；Rv2626c基因5′端 引物 Ⅲ：5′－CCGGAATTCATGACCACCGCACGCGACA－3′，3′端引物Ⅳ：5′－CCGCTCGAGCTAGCTGGCGAGGGCCAT－3′。Ⅲ、Ⅳ酶切位点分别为Eco RⅠ和XhoⅠ。引物由金斯瑞生物科技有限公司合成。

1．5 CFP－10、Rv2626c基因的扩增与克隆 以H37 Rv基因组DNA为模板，PCR扩增CFP－10、Rv2626c基因片段。反应条件：95℃，5 min；95℃，30 s，53 ℃，30 s，72 ℃，1 min，36个循环；72 ℃，7 min；4℃，保存。扩增产物经纯化试剂盒处理后，经双酶切，酶切后扩增产物经切胶回收与同样方式处理的表达质粒p ET30a在T4 DNA连接酶作用下连接，连接产物转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑选阳性重组子送南京金斯瑞生物工程有限公司测序。

1．6 目的蛋白的诱导表达 将通过测序验证正确的重组子接种于含50 mg／L卡那霉素的LB液体培养基中，待37℃振荡培养至吸光度（A600）值为0．6～0．8，加入IPTG至终浓度为1 mmol／L，继续37℃振荡培养，从开始诱导表达1 h起每隔1 h留样待检，至诱导表达6 h时止，收集菌体，进行SDSPAGE分析。

1．7 重组蛋白表达形式鉴定及纯化 收集按最佳诱导表达条件诱导的菌体，冰浴超声破碎后离心，分别收集沉淀和上清，SDS－PAGE分析目的蛋白的表达形式；采用 QIAGEN 公司6×His－tagged Ni－NTA Agarose蛋白纯化柱分离纯化带His标签的重组蛋白。

1．8 重组CFP－10、Rv2626c蛋白抗原ELISA检测通过方阵法确定抗原的最适包被浓度和最适第二抗体稀释倍数。用p H9．6包被缓冲液将重组CFP－10蛋白、Rv2626c蛋白以及2种蛋白的混合物，按2、1、0．5、0．1和0．01μg／孔进行稀释，每孔100μL加样，4℃包被过夜；次日将孔内剩余液体甩干，洗涤液洗3次；将小牛血清稀释10倍，以每孔200μL加样，37℃下封闭1 h；甩干，洗涤液洗3次；待测血清样本用PBS进行1∶50稀释，取100μL加入反应孔，37℃下放置1．5 h，将孔内剩余液体甩干，洗涤液洗3次；将 HRP－二抗按1∶500，1∶1 000和1∶1 500进行稀释，以每孔100μL加样，37℃下放置1 h；洗涤液洗3次，每孔加底物液A、B各50μL，避光反应15 min；加入1 mol／L HCl终止反应；酶标仪测定OD450值，结果判定以待测样本的OD450值于阴性对照的OD450值之比≥2．1为阳性，计算其敏感性与特异性。

2 结 果

2．1 重组CFP－10、Rv2626c质粒的鉴定 从构建阳性重组菌中挑取重组克隆，摇菌后提取质粒经双酶切鉴定（图1）。两者重组质粒酶切片段和PCR扩增片段相同，分别约为303 bp、432 bp。重组质粒测序后，其构建序列与Gen Bank中结核菌H37Rv的基因完全相同。

图1 重组质粒PET30a－CFP－10、PET30a－Rv2626c的酶切鉴定结果M：DNA marker；1：CFP－10 基 因 PCR 产 物．2－3：PET－30a－CFP－10双酶切．4：Rv2626c基因 PCR产物，5－6：PET－30a－Rv2626c双酶切片段。Fig．1 Endonuclease digestion results of expressing plasmid p ET30a－CFP－10 and p ET30a－Rv2626cM：DNA mar ker；1：PCR pr oduct of MTB CFP－10 gene；2－3：Products of Eco RⅠand Hin d Ⅲ digestion of p ET－30a－CFP－10；4：PCR product of MTB Rv2626c gene；5－6：Products of Eco RⅠand Xho I digestion of p ET－30a－Rv2626c

2．2 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 将筛选到的工程p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）、p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）经IPTG诱导后，取菌体沉淀进行SDS－PAGE分析（图2），可见明显的特异表达产物条带。重组CFP－10蛋白相对分子质量比预计分子质量大，可能是附加表达了载体上多余的序列；重组Rv2626c蛋白相对分子质量与预计相符，而未诱导的菌体没有明显的条带。

2．3 重组CFP－10、RV2626c蛋白的可溶性分析诱导后的菌体经超声波破碎，离心，分别取上清和沉淀进行 SDS－PAGE。结果见图3，重组 CFP－10、Rv2626c蛋白主要存在于上清部分，以可溶性蛋白形式存在。

2．4 重组CFP－10蛋白的纯化 收集诱导表达的菌体沉淀，经超声波破碎，离心，取上清通过镍琼脂糖凝胶纯化柱分离纯化。收集洗脱峰溶液进行SDS－PAGE分析，结果见图4。

图2 重组工程菌表达产物的SDS－PAGE电泳图M：预染蛋白质 Mar ker；1：未诱导的重组CFP－10菌株；2：诱导6 h后的重组CFP－10菌株；3：未诱导的重组Rv2626c菌株；4：诱导6h后的重组Rv2626c菌株。Fig．2 SDS－PAGE results of the p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）and p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）M：Pre－stained protein MW marker；Lane 1：p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）without IPTG induction；Lane 2：p ET－30a－CFP－10／BL21（DE3）after 6 h of IPTG induction；Lane 3：p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）wit hout IPTG induction；Lane 4：p ET－30a－Rv2626c／BL21（DE3）after 6 h of IPTG induction．

图3 重组CFP－10、Rv2626c肽段表达方式分析M：蛋白质分子量标准；1：重组CFP－10蛋白菌体超声波破碎后的上清；2：重组CFP－10蛋白菌体超声波破碎后的沉淀；3：重组Rv2626c蛋白菌体超声波破碎后的上清；4：重组Rv2626c蛋白菌体超声波破碎后的沉淀。Fig．3 Peptide expression analysis of recombinant CFP－10 and Rv2626cM：pre－stained protein MW mar ker；1：Super natant of CFP－10 expressing E．coli；2：Sedi ments of CFP－10 expressing E．coli；3：Super natant of Rv2626c expressing E．coli；4：Sedi ments of Rv2626c expressing E coli．

图4 纯化重组CFP－10蛋白、重组Rv2626c蛋白SDS－PAGE电泳图M：蛋白质分子量标准；1：重组CFP－10蛋白菌株诱导产物；2：纯化重组CFP－10蛋白；3重组Rv2626c蛋白菌株诱导产物；4：纯化重组Rv2626c蛋白。Fig．4 SDS－PAGE electrophoresis figure on r CFP－10 and r Rv2626 proteins before and after purificationM：Pre－stained protein MW mar ker；1：Super natant of CFP－10 expressing E．coli；2：Purified r CFP－10；3：Super natant of Rv2626c expressing E．coli；4：Purified r RV2626c．

2．5 ELISA分析 通过方阵法确定CFP－10肽段最适包被浓度为0．1μg／孔，Rv2626c蛋白抗原为0．1μg／孔，混合抗原最适工作浓度为0．1μg／孔，二者比例为1∶1。酶标二抗最适工作浓度为1∶1 500。然后在该条件下，用重组 CFP－10 蛋白、Rv2626c蛋白及二者组成的联合抗原对118份确诊病人血清和96份健康人血清进行检测。结果显示重组CFP－10蛋白抗原检测结核特异性抗体的总敏感性为75．4%（痰涂阳70．0%／痰涂阴76．5%），检测健康查体者对照血清特异性为85．4%（82／96）；重组Rv2626c蛋白抗原检测结核特异性抗体的敏感性为44．1%（痰涂阳45．0%／痰涂阴43．9%），检测健康查体者对照血清特异性75．0%（72／96）；联合抗原检测结核特异性抗体的总敏感性为77．1%（痰涂阳80．0%／痰涂阴76．5%），检测健康查体者对照血清特异性为82．3%（79／96）。

3 讨 论

CFP－10是1998年被鉴定出来的低分子量蛋白，又名mtbll，是一种短期培养滤液蛋白，由l hp基因编码，属于ESAT－6家族［4］。CFP－10基因大小为303 bp，编码100个氨基酸，分子量为10 k Da。只存在于结核分枝杆菌复合群及其它几种致病性分枝杆菌中，BCG及其它分枝杆菌不表达 CFP－10［5］。因此CFP－10作为抗原可以将结核病与BCG免疫以及非结核菌感染区别开来。Renshaw等研究表明，CFP－10表现出与ESAT－6相当的T细胞性免疫反应，诱导的IFN－γ的释放水平与ESAT－6相当，具有潜在的诊断应用价值。

Rv2626c抗原是MTB休眠期特异表达的蛋白之一，其功能尚不清楚。Rv2626c基因长432 bp，编码143个氨基酸，受控于休眠调节子Dos R（dormancy regulon），该基因的表达是MTB进入休眠期的重要标志之一。研究发现Rv2626c基因及其多个下游基因的表达，可使MTB进入休眠状态，抵御宿主免疫系统的杀伤。Rv2626c抗原可激发宿主机体产生较高的抗体水平，因此，Rv2626c抗原可作为鉴别MTB在宿主机体中的感染状态的血清学诊断候选抗原。

本实验采用基因工程的手段来获得目的基因，构建了CFP－10、Rv2626c蛋白的原核表达载体，并在大肠杆菌中成功表达了重组蛋白，通过对表达产物的纯化，获得了大量CFP－10、Rv2626c抗原，这为探究重组肽段在结核病血清学诊断的应用奠定了前期抗原基础。

通过酶联免疫吸附试验（ELISA）分别检测重组CFP－10、Rv2626c蛋白与两者组成的联合抗原的Ig G抗体，结果显示联合抗原检测结核特异性抗体的敏感性为77．1%，检测健康对照血清特异性为82．3%。实验数据显示，二者联合检测的敏感性和特异性较高。应进一步纯化这两种蛋白，优化实验条件，提高检测的稳定性。

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