针刺治疗脑梗死对神经元保护作用机制的实验研究

何娜 朱春雷 何欣

关于脑梗死的治疗方法很多，作为传统医学的针刺治疗法以其独有的优势倍受青睐。以往研究表明：针刺对脑缺血的治疗作用是通过减少脑缺血后神经元坏死实现的。近来研究发现，针刺对脑缺血后神经元的凋亡亦有抑制作用。本实验应用免疫组化的方法，对针刺治疗脑梗死后梗死灶周围组织中的细胞凋亡蛋白Bcl-2与Bax在24h的变化进行检测，从而为针刺治疗对抗脑缺血损伤作用机制的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar大鼠30只，体重200～250g之间（由吉林大学实验动物中心提供）。随机分为假手术组、缺血组和针刺组，每组10只。

1.2 主要试剂及仪器 Bcl-2鼠抗人单克隆抗体和Bax兔抗人多克隆抗体(美国Sant Cruz公司)，稀释度分别为1:50和1:150；SP试剂盒(美国Zymed公司)；SDZ-Ⅱ型电针治疗仪（华佗牌，上海医用仪器厂）；1%戊巴比妥。

1.3 方法 大脑中动脉梗死模型的建立:除假手术组外，各组均根据改良的Koizumi[1]线栓法制作大鼠MCAO(大脑中动脉阻断)模型。待大鼠清醒后选用Bederson[2]的方法观察大鼠的体征，出现下列体征表明模型制作成功：①右侧出现horner征；②左前肢瘫痪，将鼠尾提起大鼠不能充分伸展左前肢，当大鼠左旋时左前肢拖在腹下，与右前肢交叉成剪刀状。

穴位定位与电针方法:根据动物穴位图谱[3]，选取动物模型的外关和足三里两穴。分别于造模后15min进行30min电针干预，针刺深度1mm；以医用1寸毫针针刺入相应穴位，于针柄处接SDZ-Ⅱ型电针治疗仪。刺激参数：疏波4HZ，密波20HZ，脉冲宽度0.5ms；输出电压2～4V，输出电流4～6mA，强度以鼠尾轻颤为度。极性固定，负极接右侧足三里或外关穴，正极接鼠尾。假手术组与缺血组均不给予任何刺激。于造模24h后分别将动模处死断头剥离其脑组织，置于10%福尔马林中固定，脱水经矢状位切开，取大脑皮层进行石蜡包埋，制成厚度为5μm连续矢状切片备用。

动物模型的脑神经细胞Bcl-2和Bax的检测具体操作步骤参照试剂盒说明。

1.4 结果判定 阳性值为细胞内出现棕黄色三角型或弯月型颗粒，即有Bcl-2和Bax蛋白表达。镜下观察，在10×20倍视野下随机记数5个视野的阳性细胞总数或阳性细胞百分率，取其均值。主要观察指标：造模后24h，各组大鼠脑细胞凋亡蛋白的表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.0软件包进行处理分析，数据均以±s表示。

2 结果

2.1 实验动物数量分析 验选取Wistar大鼠30只，全部进入结果分析，中途无脱落。

2.2 显微镜观察 ①假手术组仅见微量阳性细胞散在分布（图a，图d）,无显著意义(P＞0.05)；②针刺组与缺血组(图b，图e)镜下可见阳性细胞，以针刺组阳性细胞数的表达最为明显(图c，图f)。经统计学分析：针刺组Bcl-2、Bcl-2／Bax的表达均明显高于假手术组和缺血组(P＜0.01)；Bax的表达显著低于缺血组(P＜0.01)，与假手术组基本相似(P＞0.05)。

表1 针刺对Bcl-2和Bax在皮质内的表达的影响(n=10;±s)

表1 针刺对Bcl-2和Bax在皮质内的表达的影响(n=10;±s)

注：aP＜0.05与假手术组比较。

组别 n Bcl-2 Bax Bcl-2/Bax假手术组 10 7.3±1.3 7.2±1.8 1.11±0.17缺血组 10 10.8±2.5 20.8±2.3a 0.52±0.06a针刺组 10 15.8±2.2 11.7±1.8 1.36±0.02

图1：假手术组 顶叶皮质Bax蛋白的表达；（SP法，×200） 图2：缺血组 顶叶皮质Bax蛋白的表达；（SP法，×200） 图3：针刺组 顶叶皮质Bax蛋白的表达；（SP法，×200）

图4：假手术组 顶叶皮质Bcl-2蛋白的表达；（SP法，×200） 图5：缺血组 顶叶皮质Bcl-2蛋白的表达；（SP法，×200） 图6：针刺组 顶叶皮质Bcl-2蛋白的表达；（SP法，×200）

3 讨论

针刺治疗脑梗死抑制神经细胞凋亡逐渐成为值得关注的热点问题。实验证明，针刺对脑缺血时神经细胞凋亡有明显的抑制作用[4]。电针“百会”和“水沟”穴可部分抑制局灶性脑缺血脑内c-fos表达[5]；醒脑开窍针刺法可增加梗死区皮质、纹状体、海马hsp70基因的表达[6]；针刺“内关”、“百会”、“水沟”穴可明显减轻局灶性脑缺血损伤，提高P53 蛋白的表达从而抑制细胞凋亡[7]等。

细胞凋亡（apoptosis）又谓细胞程序化死亡（programmed cell death,PCD）是一种参与生物体许多过程的细胞去除机制，由基因编程调控的细胞主动自杀过程。随着缺血时间的延长梗死灶扩大，在梗死灶的边缘区域以细胞凋亡为主，在梗死中心区以细胞死亡为主。 在Bcl-2家族中有众多成员，如Mcl-1、NR-B、A1、Bcl-w、Bcl-x、Bax、Bak、Bad、Bim等，分别有抗凋亡或促凋亡作用。多数成员间有两个结构同源区域，在介导成员之间的二聚体化过程中起重要作用。研究表明Bcl-2有抑制细胞凋亡，延长细胞寿命的作用，而Bax功能与Bcl-2功能相反，Bax和Bcl-2表达比率决定细胞是否会发生凋亡[8]。

通过观察大鼠MCAO模型建立后针刺外关、足三里两穴，于24h处死大鼠，运用免疫组化法观察细胞凋亡蛋白Bcl-2与Bax在脑细胞内的变化。结果表明当脑梗死发生后，启动脑神经细胞凋亡机制。在假手术组中可见微量阳性细胞散在分布,无显著意义；针刺组与缺血组镜下可见阳性细胞，其中以针刺组阳性细胞数的表达最为明显；针刺组Bcl-2、Bcl-2／Bax的表达均明显高于假手术组和缺血组；Bax的表达显著低于缺血组，与假手术组基本相似。证明针刺治疗脑梗死可升高Bcl-2和降低Bax的表达，从而抑制脑细胞的凋亡，挽救缺血半暗带向正常脑组织的转化，改善神经功能的作用。

[1]Koizumi T,Yoshida Y,Nakazawa T,et al.Experimental studies of ischemic brain edema.A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J].Jpn J Stroke,1986,8:1.

[2]Bederson JB,Pitts LH,Tsuji M,et al.Rat middle cerebral artery occlusion evaluation of themodel themodel and development of a neurologic evaluation[J].Stroke,1986,17:472.

[3]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社,2003:327-329.

[4]晏义平,孙凤艳.电针对大鼠脑缺血后脑内神经细胞凋亡的影响[J].针刺研究,1998,23(1):33-35.

[5]董劲松,陈伯英.即早表达基因c-fos在电针抗局灶性脑缺血损伤中作用的研究[J].针刺研究,2001,26(2):97-101.

[6]马岩 ,王舒,鲁斌,等.醒脑开窍针刺法干预实验性脑梗塞大鼠热休克蛋白基因表达的研究[J].中国针灸,2001,21(2):107-112.

[7]余晓慧,孙国杰.针刺对局灶性脑缺血大鼠p53蛋白表达的影响[J].中国中医急症,2003,12(6):557-557.

[8]郭新庆,薛爱琴,吴穹,等.70味珍珠丸对全脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区神经元的保护作用[J].当代医学,2010,17(25):1-2.