血管内皮生长因子-C/VEGFR-3在宫颈癌及上皮内瘤样变中的表达

陈志琴 陈海燕 林美姜 刘佳华

浸润性宫颈癌(invasive carcinoma of cervix，ICC)为常见妇科恶性肿瘤[1]。世界范围内，其发病率在女性肿瘤中排第2位，呈升高和低龄化趋势。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是与ICC密切相关的一组癌前病变，早期诊断和治疗CIN可降低宫颈癌的发病率及病死率，对提高患者的生活质量有着极其重要的意义。血管内皮生长因子(vascular endothlial growth factor，VEGF)C与淋巴管内皮细胞表面受体VEGFR-3结合，介导淋巴管内皮细胞的趋化增殖、分化和淋巴管的增生，是迄今公认的淋巴管生成因子。本研究采用免疫组化方法测定VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC病例中表达情况，探讨VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC中的表达变化情况，阐明宫颈癌发生发展过程中，淋巴血管形成的表型可能发生的时期。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年9月～2011年7月福建医科大学省立临床医学院妇产科门诊及住院患者为研究对象。年龄21～63岁，中位年龄36岁。分为4组：CIN I组，共33例；CINⅡ组，共32例；CIN III组，共37例；ICC组，共30例，其中9例盆腔淋巴结转移。各组术前均未行放疗、化疗，半年内未经过激素治疗。兔抗人VEGF-C多克隆抗体及兔抗人VEGFR-3多克隆抗体工作液、SP免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 免疫组化方法 将经中性福尔马林固定、石蜡包埋的宫颈病变标本连续切片2张，采用SP免疫组化染色，使用微波炉抗原热修复，抗原修复液为pH 6.0的柠檬酸缓冲液，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照，经DAB显色，苏木精对比染色后，中性树胶封片。用已知阳性片作为阳性对照，以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

1.3 结果判定

1.3.1 VEGF-C VEGF-C的阳性物质为棕黄色细颗粒状，主要位于细胞质内。高倍镜下随机取5个视野(每视野细胞数不少于200个)，按阳性细胞所占百分比及着色程度进行结果判定。按阳性细胞比例判定：阳性细胞≤10%1分，10%～50%2分，>50%3分；按染色程度判定：阴性为0分；淡黄色为1分；中度黄色为2分，棕黄色为3分。按阳性细胞得分×染色程度得分计总分，总分<3为阴性，≥3为阳性。

1.3.2 VEGFR-3 VEGFR-3阳性为淋巴管内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒。VEGFR-3脉管判断标准及计数方法：低倍镜下寻找VEGFR-3阳性脉管密集区，即热区，100倍视野计数5个热区中VEGFR-3阳性脉管数，取平均值。

1.4 统计学方法 使用SPSS11.0软件对所得数据进行统计学处理，采用χ2检验与秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

VEGF-C在CIN I、CIN Ⅱ组、CIN III组以及ICC组中的阳性率分别为6.06%、9.38%、83.78%以及86.67%。VEGFR-3在CIN I组、CIN Ⅱ组、CIN III组以及ICC组中的阳性率分别为9.09%、9.38%、81.08%以及90.00%，见表1。

表1 4组VEGF-C/VEGFR-3的阳性表达情况

ICC组VEGF-C、VEGFR-3阳性率明显高于CIN I组和CIN II组，差异有统计学意义(均P<0.05)，而与CIN III组相比差异无统计学意义(P>0.05)；CIN III组与CIN I组和CIN II组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)；CIN I组与CIN II组相比差异无统计学意义(P>0.05)。另外，7例演进为ICC的CIN III显示VEGF-C/VEGFR-3呈强阳性表达，有5例发生盆腔淋巴结转移；在ICC组26例VEGF-C阳性表达的患者中，有9例发现盆腔淋巴结转移，而4例阴性表达者中，无一例发生盆腔淋巴结转移。

3 讨论

宫颈癌的转移途径主要是直接蔓延和淋巴结转移，肿瘤是否已播散到区域淋巴结对患者的预后产生极大影响，临床多以有无淋巴结转移来评估预后及指导治疗，Ho等[2]回顾性分析197例早期宫颈癌，根据其术后病理分3组，低危组：局限于子宫，无脉管累及；中危组，盆腔淋巴结转移不伴脉管累及，或脉管累及伴间质浅层受侵；高危组：脉管累及合并深间质浸润，或髂总或腹主动脉旁淋巴转移，上述3组的5年无瘤生存率分别为89%、69%和43%，认为淋巴结转移、脉管累及和深间质浸润是影响宫颈癌预后的3大高危病理因素。因此早期预测和发现有无淋巴结转移具有重要临床意义。缘于VEGF家族的新成员VEGF-C被发现和研究之后，目前已逐渐成为肿瘤研究的热点之一。

VEGF-C是VEGF家族中的一个新成员，是淋巴管生成因子，可激活位于淋巴管内皮细胞上的VEGFR-3参与肿瘤内和瘤旁淋巴管的生成，与多种肿瘤的区域淋巴结转移密切相关。目前认为，VEGF-C通过结合并激活VEGFR-3改变淋巴屏障作用[3]，导致淋巴管增生，对胚胎发育和肿瘤的生长和转移起重要调控作用。Yonemura等[4]利用TR-PCR和免疫组化研究85例胃癌中VEGF-C/VEGFR-3的表达，发现在胃癌组织中，VEGF-C/VEGFR-3的表达之间在统计学上具有正相关。VEGFR-3主要在淋巴管内皮细胞中表达，VEGF-C主要在原发肿瘤中表达。VEGF-C的表达和淋巴结状况、淋巴的浸润、静脉的侵袭、肿瘤浸润之间有一个强的相关。Fujimoto等[5]研究40例淋巴结转移的宫颈癌患者，24例VEGF-C显著升高，淋巴结转移且VEGF-C升高者，24个月生存率为38%，无VEGF-C升高的淋巴结转移者24个月生存率81%，认为宫颈癌中VEGF-C高表达，促进肿瘤经淋巴道转移，是判断预后的指标。Van Trappen等[6]研究VEGF-C及其受体VEGFR-3在103例CIN(CIN I，II和III分别为33，33和37例)和49例宫颈鳞癌中的表达情况，免疫组化结果显示，VEGF-C和VEGFR-3的蛋白表达在宫颈癌形成的不同分期差异有统计学意义，CIN I，II和III之间差异有统计学意义(P<0.05)，而CIN III和宫颈癌之间却无明显差异。超过50%的CIN III和宫颈癌中显示VEGF-C和VEGFR-3中度至强阳性染色，而CIN I和II中仅有15%显示阳性表达。9例演进为宫颈癌的CIN III显示VEGF-C/VEGFR-3呈强阳性表达。这些结果表明，在宫颈癌发生发展过程中，淋巴血管形成的表型可能发生在CIN III期。

本研究结果显示，CIN I、CIN II组织中几乎不表达VEGF-C/VEGFR-3，而CIN III和ICC组织中VEGF-C/VEGFR-3阳性表达率明显升高，7例演进为ICC的CIN III显示VEGF-C/VEGFR-3呈强阳性表达，有5例发生盆腔淋巴结转移；在ICC组26例VEGF-C阳性表达的患者中，有9例发现盆腔淋巴结转移，而4例阴性表达者中，无一例发生盆腔淋巴结转移。

综上所述，在宫颈癌发生发展过程中，淋巴血管形成的表型可能发生在CIN III期。深刻认识VEGF-C/VEGFR-3在CIN和ICC淋巴转移中的作用，为CIN和ICC的治疗开拓了新的视野，提供新的研究方向。随着检测手段的不断进步和CIN转归机制的深入研究，尽早对CIN实行干预，可以降低ICC的发病率和病死率。

[1]周晨.56例35岁以下浸润性宫颈癌患者预后因素分析[J].当代医学，2010，16（34）：40-42.

[2]Ho CM,Chien TY,Huang SH,et al.Multivariate analysis of the prognostic factors and outcomes in early cervical cancer patients undergoing radical hysterectomy[J].Gynecol Oncol,2004,93(2):458-464.

[3]Breslin JW,Yuan SY, Wu MH.VEGF-C alters barrier function of cultured lymphatic endothelial cells though a VEGFR-3-dependent mechanism[J].Lymphat Res Biol,2007,5(2)：105-l13.

[4]Yonemura Y,Fushida S,Bando E,et a1.Lymphangiogenesis and the vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-3 in gastric cancer[J].EurJ Cancer,2001,37(7):9l8-923.

[5]Fujimoto J,Toyoki H,Sato E,et al.Clinical implication of expression of vascular endothelial growth factor-C in metastatic lymph nodes of uterine cervical cancers[J].Br J Cancer,2004,91(3):466-469.

[6]Van Trappen PO,Steele D,Lowe DG,et a1.Expression of vascular endothe1ial growth factor (VEGF)-C and VEGF-D,and their receptor VEGFR-3,during different stages of cervical carcinogenesis[J].J Pathol,2003,201(4):544-554.