不同缺血后处理对缺血再灌注大鼠脑内IL－1β、IL－6表达的影响

孔渝菡 秦新月 (重庆医科大学附属第一医院神经内科 重庆市神经病学重点实验室，重庆 400016)

脑缺血后处理(IPC)是在脑缺血后再灌注初期通过各种物理或药物方式实施的一种干预手段，是近年来发现的能减少缺血性脑损伤的方法，但其最佳实施策略及具体保护机制仍存在争议〔1〕。本研究拟探讨不同方式的缺血后处理对MCAO/再灌注大鼠缺血侧IL-1β、IL-6表达的影响及轴突损伤情况，推测缺血后处理的可能机制。对于临床上缺血性脑血管疾病的防治具有积极的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年健康SD大鼠，体重250～280 g，雌雄各半，由重庆医科大学实验动物中心提供。大鼠25只，随机分为5组，分别为假手术组、缺血/再灌注组(I/R)、近端后处理组(IPC)、远隔后处理组(RIPC)、延迟后处理组(DIPC)，每组5只。选术后48 h为观察时间点，实验过程中动物饲养及取材均遵守实验动物管理和保护的有关规定。

1.2 局灶性缺血再灌注模型制作 大鼠术前称重，腹腔注射3.5%水合氯醛(1 ml/100 g)，根据Longa等〔2〕报道的方法制作大鼠大脑中动脉缺血/再灌注(MCAO)模型碘附消毒颈部皮肤，作颈部正中切口，暴露右侧的颈总动脉，颈外动脉和颈内动脉，烧断颈外动脉和颈内动脉的分支，并结扎烧断颈外动脉，用眼科剪在颈外动脉残端做一切口，将预先浸好石蜡的渔线从颈外动脉切口缓慢插入颈内动脉，在渔线进入约18～20 mm(从颈外动脉分叉处算起)微感到阻力时，在颈外动脉处结扎切口，完成右侧MCA血流阻塞。再灌注方法为MCA血流阻塞2 h后将栓线退到颈总动脉分叉处。

1.3 缺血后处理实施方案 分离大鼠双侧颈总动脉，再灌注后立即夹闭双侧颈总动脉，IPC组:同时阻断双侧颈总动脉(bCCA)血流5 min，恢复5 min，如此进行3次缺血/再灌注过程;RIPC组:分离并阻断右下肢股动脉血流5 min，恢复5 min，如此进行3次缺血/再灌注循环;DIPC组:阻断bCCA血流5 min，恢复5 min，如此进行3次缺血/再灌注循环。

1.4 组织学检测 固定后的大鼠脑组织经石蜡包埋后切片，于前囟后方2 mm处进行连续冠状切片(片厚4 μm)，按说明书进行免疫组织化学法染色、DAB显色并封片。在荧光显微镜下观察阳性细胞，每张免疫组化切片中采集5个具有代表性的高倍视野，通过Image Pro Plus 6.0软件测量分析光密度值(OD)。

2 结果

2.1 不同方式缺血后处理后大鼠缺血侧皮质及海马的IL-1β、IL-6表达 在皮质区，I/R组48 h后IL-1β、IL-6含量显著高于假手术组(P＜0.01)。IPC与RIPC组和 I/R组比较，IL-1β、IL-6含量显著降低(P＜0.05)。DIPC组与I/R组比较差异不明显。在海马区缺血/再灌注48 h后大鼠海马CA1～CA3区可见IL-1β、IL-6阳性细胞表达，除DIPC组外，其余后处理组与I/R组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表1，图1，图2。

2.2 不同方式缺血后处理后大鼠缺血侧皮质及海马NF-200表达 脑缺血后神经轴突发生坏死、形态紊乱，NF-200表达减少，在皮质区神经轴突，I/R组NF-200光密度值显著低于假手术组(P＜0.01)。IPC与RIPC组和I/R组比较，NF-200表达明显增多(P＜0.01)。DIPC组与I/R组比较差异不明显(P＞0.05)。在海马缺血/再灌注48 h后大鼠海马轴突可见明显的NF-200表达，除DIPC组外，其余后处理组与I/R组比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2，图3。

表1 各组大鼠缺血侧皮质及海马IL-1β光密度值、IL-6光密度值(± s，n=5)

表1 各组大鼠缺血侧皮质及海马IL-1β光密度值、IL-6光密度值(± s，n=5)

与假手术组比较:1)P＜0.01;与 I/R组比较:2)P＜0.01，3)P＜0.05，下表同

组别 IL-1β的光密度值皮质 海马IL-6的光密度值皮质 海马假手术组 0.13±0.026 0.14±0.021 0.23±0.034 0.24±0.031 I/R 0.42±0.0381) 0.34±0.0421) 0.58±0.0501) 0.50±0.0471)IPC 0.37±0.0301)3)0.29±0.0341)3)0.48±0.0481)2)0.43±0.0461)3)RIPC 0.35±0.0421)2)0.29±0.0461)3)0.49±0.0491)2)0.44±0.0531)3)DIPC 0.40±0.0411) 0.33±0.0301) 0.55±0.0791) 0.47±0.0441)

表2 各组大鼠缺血侧皮质及海马NF-200光密度值表达(± s，n=5)

表2 各组大鼠缺血侧皮质及海马NF-200光密度值表达(± s，n=5)

组别 皮质 海马假手术组0.54±0.051 0.54±0.069 I/R 0.20±0.0351) 0.17±0.0441)IPC 0.31±0.0841)2) 0.37±0.0471)2)RIPC 0.31±0.0441)2) 0.25±0.0491)3)DIPC 0.21±0.0451) 0.21±0.0321)

图1 不同缺血后处理后缺血侧皮质IL-1β表达(DAB，×200)

图2 不同缺血后处理后缺血侧皮质IL-6表达(DAB，×200)

图3 缺血48 h后缺血侧皮质和海马的轴突(DAB，×200)

3 讨论

炎症、凋亡及细胞因子的上调在缺血性脑损伤中起着重要作用。IL-1β，IL-6作为炎症因子的重要组成部分在一定程度上反映了炎症的严重程度。IL-1β受促炎症因子TNF-α诱发激活，并协同刺激IL-6产生，在缺血性脑损伤中增高，并产生级联效应加重缺血局部的免疫炎症反应而加重神经系统的损害〔3，4〕。本研究提示缺血后处理可能减少了脑缺血后出现的急性炎症反应这一重要病理过程从而起到神经保护作用。NF-200是神经微丝与其他细胞骨架(微管等)的主要联系体，它是一种与神经元生长、发育过程有关的蛋白，主要存在于神经元轴突。脑缺血后神经轴突发生坏死、形态紊乱，NF-200表达减少，当神经修复时由于神经再生需要，神经元在各种诱导因子作用下使NF合成增多，并通过轴浆运输到轴突，NF-200表达增加〔5〕。由此NF-200能反映脑损伤后神经损伤和修复的程度。本研究显示，通过缺血后处理的实施，各组大鼠脑组织中NF-200表达降低，提示几种后处理方式均能不同程度地减轻脑缺血造成的神经轴突损伤，保护轴突的完整进而促进神经的再生和修复。

缺血后处理的方式可以是近缺血部位也可以是远隔部位的处理，且均能有效减少缺血部位的损伤，这为它的临床应用提供了良好的拓展空间。通过本研究，我们认为5 min×3循环的近端和远隔部位后处理均能有效减少脑缺血再灌注损伤，这和以往报道缺血后处理具有器官保护作用的情况类似〔1〕。而1 d后的延迟后处理没有起到明显的脑保护作用，提示1 d后延迟保护时相可能已过〔6〕。综上我们推论，早期进行近端或远隔部位的缺血后处理能减少脑缺血再灌注后发生的炎症反应，保护神经轴突，从而减小再灌注损伤，为神经再生提供有利环境。

1 Zhao H.Ischemic postconditioning as a novel avenue to protect against brain injury after stroke〔J〕.J Cereb Blood Flow Metab，2009;29:873-85.

2 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

3 van der Pouw Kraan TC，Kasperkovitz PV，Verbeet N，et al.Genomics in the immune system〔J〕.Clin Immunol，2004;111:175-85.

4 Yang J，Ding JW，Chen LH，et al.Sequential expression of TLR4 and its effects on the myocardium of rats with myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕.Inflammation，2008;31:304-12.

5 Shaw G，Yang C，Ellis R，et al.Hyperphosphorylated neurofilament NF-H is a serum biomarker of axonal injury〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2005;336:1268-77.

6 Ren C，Gao X，Niu G，et al.Delayed postconditioning protects against focal ischemic brain injury in rats〔J〕.PLoS One，2008;3:e3851.