阿德福韦酯长期治疗对慢性乙型肝炎患者PBMCs中线粒体DNA的影响*

刘晓宇 周 莉 段钟平 赵彩彦

阿德福韦酯于2002年由美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市用于治疗慢性乙型肝炎（CHB），至2008年，全世界服用阿德福韦酯的患者大约为41万人/年，并于2008年被批准用于12～17岁儿童患者[1]。阿德福韦酯在细胞激酶的作用下被磷酸化为有活性的代谢产物即阿德福韦酯二磷酸盐，后者通过与自然底物脱氧腺苷三磷酸盐竞争或是整合到病毒DNA后引起DNA链延长终止而发挥抗病毒作用[2]。一般情况下，阿德福韦酯不会影响人类DNA复制和修复，但若长期应用，随着药物浓度的不断积聚，仍可能对DNA聚合酶γ产生一定的毒性作用。该酶是线粒体复制中的关键酶。因此，该酶受损后，势必会影响到线粒体的数量和功能。

阿德福韦酯的主要不良反应是可引起肾小管肾病，而肾毒性发生率与药物剂量相关。当药物剂量≥30mg/d时，其肾病的发生率为22%～50%，而药物剂量在10mg/d时，其发生率与安慰剂相似。肾毒性的发生机制可能与药物对线粒体的毒性有关[3]。Tanji N等[4]对阿德福韦酯相关性肾损害患者肾脏的超微结构研究发现，近端小管线粒体肿大、变形，线粒体DNA数量明显减少，细胞色素C氧化酶缺乏，细胞氧化和呼吸功能丧失。Izzedine H等[5]认为肾小管部位较高浓度的阿德福韦酯可抑制肾细胞线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）的合成，从而导致近曲小管mtDNA损耗，线粒体功能明显降低，影响肾小管的重吸收和分泌功能。严重时可导致肾小管细胞凋亡，临床上表现为近曲小管功能障碍。研究表明，长期服用核苷类似物引起的乳酸酸中毒、脂质代谢紊乱、横纹肌溶解、胰腺炎和周围神经病变等不良反应均与线粒体病变有关[6～10]。

外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells，PBMCs）中mtDNA在一定程度上能够反应组织mtDNA的改变。吴亚松等[11，12]研究指出，发生脂质代谢紊乱的AIDS患者PBMCs中mtDNA含量比未发生脂质代谢紊乱的患者显著降低。由于PBMCs中线粒体较组织中易于获得，因此可用其来监测线粒体的损伤情况。本研究观察了服用阿德福韦酯3年以上的65例CHB患者PBMCs中线粒体的损伤情况。

资料与方法

一、研究对象 选自2010年7月～2011年3月首都医科大学附属北京佑安医院门诊就诊的未经抗病毒治疗或接受阿德福韦酯单药治疗的CHB患者，诊断均符合2000年病毒性肝炎防治方案[13]，其中对照组22例，为首次发病，尚未进行过抗病毒治疗（对照组）；阿德福韦酯单药连续治疗2年组18例（2年组）；阿德福韦酯单药连续治疗3年组25例（3年组）。排除合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染及药物性、自身免疫性、酒精性肝损害和肝硬化患者。

二、观察指标 使用OLYMPUS AU5400全自动生化分析仪检测血生化指标；采用荧光PCR法检测血清HBV DNA含量（罗氏试剂盒和罗氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan48分析仪）；采用ELISA法检测血浆丙二醛（malondialdehyde，MDA）和F2-isoprostanes含量（上海Blue Gene公司）；采用分光光度法检测血浆总抗氧化能力（total antioxidant capability，TAOC）含量（南京建成试剂和上海尤尼柯仪器有限公司生产的UV-2600型紫外可见分光光度计）。

三、PBMCs中mtDNA的提取和测定 取9ml EDTA抗凝静脉血，1h内常规方法分离PBMCs，计数。取约1×106个细胞，用DNA提取试剂盒（德国 QIAGEN公司）提取DNA，以线粒体编码的基因细胞色素C氧化酶Ⅱ（coxⅡ）的拷贝数作为mtDNA拷贝数，磷酸甘油醛脱氢酶为核DNA（nuclear DNA，nDNA）内参照。采用mtDNA/nDNA表示mtDNA含量。其中PCR引物和探针（美国Invitrogen公司）序列为：mtDNA cox II引物：上游5'-TATCTTTTGGCGGTATGCACTTTTAACAGT-3'， 下 游 5'-TGATGAGATTAGTAGTATGGGAGTGG-3'， 探 针 5'-FAM-CACCCCCCAACTAACACATTATTTTCCCC-TAMRA-3'；核DNA引物：上游 5'-GCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCT-3'，下 游 5'-TGATGACCTGGCCGTCAGGCAGCTC-3'，探针 5'-FAM-GCCGGGACCTGACTGACTACCTCATGA-TAMRA-3'。试剂购自美国ABi公司，所用仪器为Step One Plus Real-time PCR仪，分析软件为Step One Plus software（美国AB公司）。

表1 各组人群基线情况

四、统计学处理 计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析法进行组间差异的比较。计数资料采用x2检验或Fisher’s确切概率法进行组间差异的比较。应用SPSS 13.0统计分析软件，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、各组人群基线情况 各组患者性别比例、年龄、HBsAg阳性持续时间的差异均无统计学意义，具有可比性。三组ALT、AST和HBV DNA水平比较，差异有统计学意义（F/2 值分别为 26.972，15.667，16.865，P值分别为0.000，0.000，0.000）。进一步比较服用阿德福韦酯2年和3年组结果显示，ALT、AST和HBV DNA差异无统计学意义（P值分别为0.716，0.757，0.927，均＞0.05），见表1。

二、3组患者PBMCs中mtDNA水平和有关指标的比较 见表2。

表2 各组有关指标（）的比较

表2 各组有关指标（）的比较

与对照组比，①P＜0.05

血清TAOC（单位/毫升）对照组 1.4±1.2 10.4±6.7 3.7±2.7 4.3±1.8 2年组 0.6±0.4① 8.1±4.7 1.5±0.8① 3.0±1.1①3年组 0.8±0.5① 6.7±3.2 2.2±1.3① 2.3±1.4①F 5.878 2.404 7.300 10.888 P 0.005 0.099 0.001 0.000 PBMCs mtDNA（copies/cell）血清MDA（ng/ml）F2-isoprostanes（ng/ml）

三、不良反应 用药期间各组患者均未见明显不良反应。

讨论

线粒体是一种半自主细胞器，可独立于核DNA之外自主地进行复制、转录和翻译。mtDNA由16 569bp组成，编码2个rRNA基因（16SrRNA，12SrRNA），22个tRNA基因，13个蛋白基因（包括1个细胞色素b基因，2个ATP酶亚单位基因和7个呼吸链脱氢酶亚单位基因）。mtDNA能合成自身所需的一部分蛋白质，线粒体中大部分蛋白质是核基因编码的。阈值效应是指当mtDNA突变达到一定比例时，才会出现受损表型；由于mtDNA缺乏修复系统及组蛋白保护，所以易受活性氧等自由基的侵害而突变率高。mtDNA可通过母系遗传。线粒体的生命周期有限，平均寿命约为10天，具有较高的更新率，需不断复制。因此，当药物浓度高达能够抑制HBV DNA聚合酶γ时，则会导致线粒体合成减少，从而诱导突变的发生，但只有当损害达一定程度时才会出现受损表型[17]。

线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成三磷酸腺苷（ATP）的主要场所，也是调控细胞凋亡和活性氧产生的重要部位。当线粒体异常或减少达一定程度时即可影响其氧化磷酸化功能，使ATP生成减少，活性氧生成增加，出现细胞功能障碍或细胞凋亡。在体外试验中，许多抗HBV核苷（酸）类似物在高于人体治疗剂量10～100倍时可表现出线粒体毒性。

本研究发现，服用阿德福韦酯2年后，mtDNA含量已经减少，但继续服用阿德福韦酯1年，mtDNA含量则无进一步下降。已有研究表明，HBV本身会影响线粒体功能。张树林等[14]研究发现HBV侵犯PBMCs可致线粒体功能降低，能量代谢异常。Tan C等[15]研究指出HBV复制会引起线粒体膜通透性转换孔开放，导致钙外流，引发细胞凋亡。Lin N等[16]报道HBV可以下调细胞色素C氧化酶II表达，抑制线粒体细胞色素C氧化酶活性，导致氧自由基产生增多。Stankov MV[17]等在研究核苷（酸）类似物对人皮下脂肪组织中mtDNA缺失和呼吸链功能的影响时发现，mtDNA缺失达50%时，呼吸功能仍不会受到影响。而HBV本身已经损伤了线粒体功能，也就是说，HBV的作用可导致mtDNA大量减少。

在核苷类似物治疗AIDS患者的研究中发现，短时间用药可以改善PBMCs中mtDNA含量，长时间用药会导致mtDNA数量下降[18，19]，这与本研究结果有所不同。本实验阿德福韦酯用量为10mg/d，服药达3年时或许尚未达到毒性浓度，且线粒体的损伤存在阈值效应。因此，尚不能确定更长时间用药对线粒体的损伤情况，需要进一步观察。

本研究发现，服药2年时，患者血F2-isoprostanes较对照组显著降低。F2-isoprostanes是自由基催化生物膜上的花生四烯酸发生脂质过氧化（非酶促反应）后的特异性产物，不受饮食的影响，能灵敏准确地反映体内氧化应激水平，并与疾病的严重程度相关，是评估脂质过氧化最可靠的生化指标[20]。我们推测，HBV导致的线粒体损伤远大于阿德福韦酯对线粒体复制的抑制。加之，只有当线粒体减少达一定比例时，才会导致其功能的异常[17]。

机体有酶类和非酶类两大抗氧化防御体系，各抗氧化剂之间既有协同作用又有相互依赖和保护作用。TAOC代表机体实际抗氧化能力的总和，能比单一抗氧化剂提供更准确的信息[21]。MDA是氧自由基与生物膜上的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的最终产物，但不是特异性产物。MDA可与DNA和蛋白等生物大分子相互作用，破坏其功能。MDA也可损害线粒体，其对线粒体的作用是呈剂量依赖性的。MDA可以通过抑制线粒体呼吸链和一些酶的活性引起线粒体功能紊乱[22]。本研究结果显示，3组间MDA含量差异无统计学意义。F2-isoprostanes较MDA更容易从尿液排出[23]。因此，后者更能及早准确地反应体内抗氧化能力的变化。

[1]Fontana RJ.Side effects of long-term oral antiviral therapy for hepatitis B.Hepatology，2009，（5 Suppl）:S185-195.

[2]Lewis W，Day BJ，Copeland WC.Mitochondrial toxicity of NRTI antiviral drugs:an integrated cellular perspective.Nat Rev Drug Discov，2003，2（10）:812-822.

[3]王桂爽，蔡皓东.阿德福韦酯和替诺福韦相关性肾小管病.药物不良反应杂志，2010，12（1）:31-40.

[4]Tanji N，Tanji K，Kambhan N，et al.Adefovir nephrotoxicity:possible role of mitochondrial DNA depletion.Hum Pathol，2001，32（7）:734-740.

[5]Isnard-Bagnis C，Moulin B，Launay-Vacher V，et al.Anticancer drug-induced nephrotoxicity.Nephrol Ther，2005，1 （2）:101-114.

[6]吴焱，伦文辉，闫会文，等.HAART相关症状性高乳酸血症的临床特征及影响因素分析.中国艾滋病性病，2009，15（1）:4-8.

[7]Chiappini F，Teicher E，Saffroy R，et al.Relationship between polymerase gamma（POLG） polymorphisms and antiretroviral therapy-induced lipodystrophy in HIV-1 infected patients:a case-control study.Curr HIV Res，2009，7（2）:244-253.

[8]吴荣荣，陈红鸽，刘淼，等.替比夫定引起神经肌肉病变的临床观察. 中国新药杂志，2009，18（20）:2004-2008.

[9]Klusa V，Pupure J，Isajevs S，et al.Protection of azidothymidine-induced cardiopathology in mice by mildronate，a mitochondria-targeted drug.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2006，99（4）:323-328.

[10]Arenas-Pinto A，Bhaskaran K，Dunnd D，et al.The risk of developing peripheral neuropathy induced by nucleoside reverse transcriptase inhibitors decreases over time:evidence from the Delta trial.Antivir Ther，2008，13（2）:289-295.

[11]吴亚松，陈新月，石英，等.HIV感染和抗反转录病毒治疗对PBMC 线粒体 DNA 含量影响.北京医学，2010，32（6）:431-436.

[12]Chene G，Amellal B，Pedrono G，et al.Changes in the peripheral blood mtDNA levels in naive patients treated by different nucleoside reverse transcriptase inhibitor combinations and their association with subsequent lipodystrophy.AIDS Res Hum Retroviruses，2007，23（1）:54-61.

[13]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会.病毒性肝炎防治方案.中华肝脏病杂志，2000，8:324-329.

[14]张树林，吴宁强，梁雪松，等.HBV侵犯PBMC致线粒体功能改变. 世界华人消化杂志，1997，5（12）:783-784.

[15]Tan C，Guo H，Zheng M，et al.Involvement of mitochondrial permeability transition in hepatitis B virus replication.Virus Res，2009，145（2）:307-311.

[16]林纳，李丹，陈红英，等.HBV X基因对成人肝细胞HL-7702线粒体功能的影响.细胞与分子免疫学杂志，2008，24（10）:972-974.

[17]Stankov MV，Lucke T，Das AM，et al.Mitochondrial DNA depletion and respiratory chain activity in primary human subcutaneous adipocytes treated with nucleoside analogue reverse transcriptase inhibitors.Antimicrob Agents Chemother，2010，54（1）:280-287.

[18]De Mendoza C，De Ronde A，Smolders K，et al.Changes in mitochondrial DNA copy number in blood cells from HIV-infected patients undergoing antiretroviral therapy.AIDS Res Hum Retroviruses，2004，20（3）:271-273.

[19]Timmermans EC，Tebas P，Ruiter JP，et al.Real-time nucleic acid sequence-based amplification assay to quantify changes in mitochondrial DNA concentrations in cell cultures and blood cells from HIV-infected patients receiving antiviral therapy.Clin Chem，2006，52（6）:979-987.

[20]Wang CN，Chen JY，Sabu S，et al.Elevated amniotic fluid F2-isoprostane:a potential predictive marker for preeclampsia.Free Radic Biol Med，2011，50（9）:1124-1130.

[21]Hermsdorff HH，Puchau B，Volp AC，et al.Dietary total antioxidant capacity is inversely related to central adiposity as well as to metabolic and oxidative stress markers in healthy young adults.Nutr Metab（Lond，2011，8（1）:59.

[22]Long J，Wang X，Gao H，et al.Malonaldehyde acts as a mitochondrial toxin:inhibitory effects on respiratory function and enzyme activities in isolated rat liver mitochondria.Life Sci，2006，79（15）:1466-1472.

[23]Basu S.Radioimmunoassay of 8-iso-prostaglandin F2alpha:an index for oxidative injury via free radical catalysed lipid peroxidation.Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids，1998，58（4）:319-325.