大理地区健康人阴道念珠菌体外药物敏感性研究

何 伟，陈财发，姚 毅，朱 文，杨泽丽，白 丽*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.大理学院公共卫生学院，云南大理 671000）

念珠菌属条件致病性酵母样真菌，常寄生于人体与外界相通的腔道中，如口腔、肠道、阴道等，健康人群携带率较低（口腔中约9%）〔1〕。由各种原因（如HIV感染，抗生素的滥用等）导致机体抵抗力下降、菌群失调或寄生位置发生改变所致的真菌机会性感染呈日益增多的趋势，其中主要是念珠菌病〔2-3〕。随着抗真菌药物在黏膜念珠菌病中的广泛使用，念珠菌的敏感性逐渐降低，耐药株呈现增加趋势。抗真菌药物敏感性的研究变得尤为重要。本文采用美国临床和实验室标准化研究所（The Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI） 推荐的M27-A2方案，即微量液基稀释法，通过对分离自大理地区健康女性阴道念珠菌的药物敏感性的分析，为临床抗真菌药物的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株 分离自大理健康人群阴道念珠菌45株。 经过鉴定〔4〕，包括29株光滑念珠菌（Candida glabrata），11株白色念珠菌 （ Candida albicans），4株克柔念珠菌（Candida krusei），1株热带念珠菌（ Candida tropicalis） 。

1.2 标准菌株 ATCC10029（大理学院病原生物学综合实验室保存）作为4种药物的敏感性标准株。

1.3 RPMI-1640液的配制 取10.4 g RPMI-1640粉（含L谷氨酰胺，不含碳酸氢钠，GIBCO）溶于900 mL无菌水中，加入34.53 g三氮吗啡啉丙磺酸（MOPS，夏斯生物）至其终浓度为0.165 mol/L，室温下用磁力搅拌器混匀2～3 h，使其充分溶解，用1 mol/L NaOH调pH至7.0（25℃），用灭菌双蒸水定容至1 L，滤过除菌，备用。

1.4 抗真菌药物

1.4.1 储存液 储存液的浓度为应用液10倍，5-氟胞嘧啶（Fluorocytosine，5-FC）和氟康唑（Fluconazole，FCZ） 为1280 μg/mL， 两性霉素B（ AmphotericinB，AMB） 和酮康唑（ Ketoconazole，KCZ） 为320 μg/mL，分装于-70℃保存备用。4种药物均来源于中国药品生物制品检定所。

1.4.2 应用液的制备 用RPMI-1640液将储存液作1∶10稀释，FCZ和5-FC为128～0.25 μg/mL10个系列浓度，AMB和KCZ为32～0.06 μg/mL10个系列浓度，均为两倍终浓度。

1.4.3 微量药敏培养板的制备 使用96孔平底微量培养板，1～10列分别加入系列浓度梯度的抗真菌药物的应用液，从高浓度到低浓度，11列及12列加入RPMI-1640液（作为生长对照及空白对照），每孔100 μL，放入-20℃冰箱备用，使用时需经4℃和室温各1 h。

1.5 药敏试验

1.5.1 念珠菌的激活与稀释 将待测菌株在YPD（ 1%yeast extract，1%peptone，2%dextrose） 琼脂培养基上两次激活后，用生理盐水配制菌悬液，取少许，在血细胞计数板上计数，用RPMI-1640液调整浓度为3×103CFU/mL（ 2倍终浓度）。

1.5.2 加样 在上述制备好的含抗真菌药物的培养板上加入念珠菌悬液，每孔100 μL，空白对照不加，振荡混匀后放入湿盒中，35℃孵育48 h后观察结果。

1.5.3 结果判断 肉眼判断结果，以生长对照孔为依据，AMB为完全抑制即MIC 100作为观察终点，液体清亮；其余3种药以80%抑制作为观察终点，即MIC 80为观察终点，菌体生长明显减少，液体轻微浑浊；同时阳性生长对照孔中生长良好，空白对照清亮，无菌生长，质控菌株MIC值在CLSI推荐的M27-A2方案规定的范围内，才能判断实验的有效性。质控菌株对抗真菌药物的MIC值符合CLSI推荐的M27-A2方案关于质控菌株标准的要求〔5〕。

1.6 四种常用抗真菌药物敏感性判断标准 根据菌株的MIC值范围，参照文献〔1，6〕，判断念珠菌的敏感程度，分为敏感（susceptible，S）、剂量依赖性敏感（ susceptible dose-dependent，SDD）、和耐药（ resistant，R） 3种。 见表1。

表1 抗真菌药物敏感性判断标准（MIC）（μg/mL）

2 实验结果

2.1 阴道念珠菌分离株对四种药物敏感性 45株健康人群阴道念珠菌对抗真菌药物FCZ、KCZ、5-FC、AMB的耐药率分别为：8.89%、6.67%、6.67%、2.22%，敏感率分别为：80%、84.44%、91.11%、97.78%，见表2。

表2 45株阴道念珠菌对四种抗真菌剂的药物敏感性n（%）

比较4种抗真菌药物的耐药率，经卡方检验χ2=1.829，P=0.609，4种药物的耐药率差异无统计学意义。比较4种抗真菌药物的敏感率，经卡方检验χ2=7.881，P=0.049，4种药物的敏感率差异有统计学意义；经秩和两两检验，45株念珠菌对4种抗真菌药物的敏感率除AMB的药物敏感性比FCZ好（P=0.008），AMB的药物敏感性比KCZ的好（P=0.027）外，其余药物的敏感率差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 交叉耐药情况及其MIC值 结果显示1株克柔念珠菌（425） 同时对FCZ、KCZ和5-FC三种药物耐药，另一株克柔念珠菌（460）对KCZ和5-FC同时耐药，说明存在交叉耐药现象，且都是克柔念珠菌。见表3。

表3 8株耐药念珠菌对抗真菌药物的MIC值（ μg/mL）

3 讨论

近年来，念珠菌的感染率逐渐升高，临床选择敏感的抗真菌药物治疗感染显得越来越重要〔7〕。本研究调查了分离自大理地区健康女性阴道45株念珠菌对临床常用的四种抗真菌剂的敏感性，结果显示分离株对AMB的药物敏感率最高（97.78%），FCZ的药物敏感率最低（80%）；药物敏感率除AMB的药物敏感性比FCZ好（P=0.008），AMB的药物敏感性比KCZ的好（P=0.027）外，其余药物的敏感率差异无统计学意义（ P＞0.05），这与郭利军〔8〕等报道的AMB敏感性最好相符。药物的耐药率差异无显著性，与之前近年国内周讯〔9〕等报道比较的相比，念珠菌对FCZ、KCZ和5-FC耐药率相似，对AMB耐药率相差较大，这可能与近年来临床上和个人常用抗真菌药物为唑类有关。提示今后念珠菌的感染在用药上应注意联合用药，在唑类药物效果不明显时考虑应用两性霉素。45株念珠菌中有2株同时耐受多种抗真菌药物，且都为克柔念珠菌，此交叉耐药现象与Rex〔10〕等报道的相似，这提示临床用药要注意耐药株的存在，特别是具有交叉耐药性的克柔念珠菌。综上所述，4种临床常用抗真菌药物均可选作阴道念珠菌病的治疗，但相比而言，更推荐使用AMB，同时应注意某些菌株的剂量依赖性敏感、耐药及交叉耐药现象，尤其是克柔念珠菌。

〔1〕武有聪，陈兆芳，刘奇，等.HIV感染者与健康人群口腔念珠菌的体外药物敏感性比较〔J〕.中国人兽共患病学报，2009，25（ 9）：878-881，849.

〔2〕Lu JJ，Lee SY， Chiueh T S.In vitro antifungal susceptibility testing of Candida blood isolates and evaluation of the E-test method〔J〕.J Microbiol Immunol Infect， 2004， 37（ 6）：335-342.

〔3〕袁有华，白丽，武有聪，等.吸毒人群口腔假丝酵母药物敏感性分析〔J〕.中国公共卫生，2011，27（ 9）：1137-1139.

〔4〕白丽，申元英，王晶，等.健康人群口腔念珠菌的分离及菌种分布〔J〕.中国微生态学杂志，2005，17（ 2）：33-34.

〔5〕National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts.Approved standard，2nd ed.M27-A2.Wayne， Pa： National Committee for Clinical Laboratory Standards〔S〕.2002.

〔6〕王端礼.医学真菌学实验室检验指南〔M〕.北京：人民卫生出版社，2005：103-110.

〔7〕Córdoba S，Vivot W，Bosco-Borgeat ME，et al.Species distribution and susceptibility profile of yeasts isolated from blood cultures：results of a multicenter active laboratory-based surveillance study in Argentina〔J〕.Rev Argent Microbiol，2011，43（ 3）：176-185.

〔8〕郭立军，白丽，王晶，等.男性STD病人治疗后泌尿道念珠菌感染情况及敏感分析〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2009，23（ 1） ：36-38.

〔9〕周讯，李桂明.110株念珠菌的菌种鉴定及药敏试验〔J〕.重庆医科大学学报，2007，32（ 4）：425-427.

〔10〕Rex JH，Rinaldi MG，Pfaller MA，et al.Resistance of Candida Species to fluconazole〔J〕.Antimicrob Agents Chemother， 1995，39（ 1） ：1-8.