胶原抗原肽表位诱导的耐受性抗原递呈细胞对大鼠类风湿关节炎的治疗作用*

宋新强，骆 媛，李倩倩，董晶晶，甘小青，马 云

1)信阳师范学院生命科学学院免疫学教研室信阳464000 2)军事医学科学院附属医院北京100071

(2011-03-25收稿 责任编辑 李沛寰)

研究［1-3］表明抗原递呈细胞(antigen presenting cell，APC)直接与抗原特异的T细胞接触能够诱导出特异的耐受性APC，这种APC会特异地抑制自身反应性T细胞，所以，使用这种耐受性APC治疗T细胞介导的自身免疫性疾病有潜在的临床应用价值。胶原诱导的关节炎(collagen induced arthritis，CIA)是目前国际上公认的关节炎模型。由于胶原不溶于水，一般使用弱酸来溶解，为避免溶解胶原所使用的醋酸影响细胞的生长，作者用胶原上的抗原肽表位(collagen tolerance epitope，CTE)1和 CTE2(即T细胞决定簇)代替胶原刺激APC，拟利用TGF-β处理和CTE诱导的APC来探索治疗关节炎的疗效，希望为临床治疗类风湿关节炎摸索出一种全新的策略。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 肿瘤生长因子(tumor growth factor-β，TGF-β2)、鸡Ⅱ型胶原(Type Ⅱ collagen，CⅡ)、佛波醇酯、离子霉素和蛋白转运抑制剂莫能菌素均购自美国Sigma公司;FITC标记的抗IFN-γ单克隆抗(mAb)、PE标记的抗IL-4 mAb均购自美国BD公司，流式细胞分析仪由美国BD公司制造。CTE1和CTE2根据文献［4］的方法表达、纯化获得。

1.2 免疫性APC与耐受性APC的获得 免疫性APC与耐受性APC参考文献［5］通过体外诱导产生。Wistar大鼠腹腔注射6 mL 30 g/L的巯基乙酸盐溶液，3 d后收集腹膜渗出细胞(peritoneal exudate cell，PEC)。PEC 在含 500 mg/L CTE 和 5 μg/L TGF-β2的无血清培养液中过夜，即获得耐受性APC;培养液中不加TGF-β2，获得免疫性 APC。培养后，细胞用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗3次，除去CTE和TGF-β2，贴壁细胞在4℃PBS中培养2 h后，用移液管吹起，用HBSS洗3次并重悬，调整最终浓度为1 ×107L－1。

1.3 动物模型的建立与分组 雌性Wistar大鼠购于北京军事医学科学院动物中心，体质量(190±15)g，饲养在清洁级环境中。32只大鼠分为4组，即关节炎组、免疫性细胞组、耐受性细胞组和正常对照组，每组8只。将鸡CⅡ用0.01 mmol/L的冰醋酸溶解后，配成4 g/L的溶液，加等体积完全福氏佐剂，使终浓度为2 g/L。以0.1 mL/只在尾根部和背部多点注射，1周后从腹部注射0.1 mL/只加强免疫1次。加强免疫后1周，分别给免疫性细胞、耐受性细胞和关节炎组大鼠尾静脉一次性注射免疫性APC(1×106个细胞/大鼠)、耐受性APC(1×106个细胞/大鼠)和HBSS，正常对照组不注射任何物质，1周后开始检查各种指标。

1.4 大鼠四肢关节肿胀程度评估 大鼠四肢关节肿胀程度按0～4级评分［4］:无肿胀为0分;趾关节稍肿为1分;小趾关节和足趾肿胀为2分;踝关节以下足爪肿胀为3分;包括踝关节在内的全部足爪肿胀为4分。四肢关节肿胀评分之和为每只大鼠的关节炎指数，最高可达16分。

1.5 血清中抗CⅡ抗体的检测 细胞输入4周后，从尾部静脉取血，离心后－20℃储藏备用。抗体的检测参照Fujii等［5］的方法进行。以酶标分光光度计490 nm处的吸光度(A)值表示。

1.6 外周血中Th1、Th2细胞的检测 取外周血淋巴细胞置于48孔培养板内，每孔1 mL，加佛波醇酯(50μg/L)、离子霉素(500μg/L)和蛋白转运抑制剂莫能菌素(2μmol/L)在37℃孵箱中培养5 h。收集细胞分为对照管和实验管，分别加入抗 CD4 mAb混匀，室温放置20 min对细胞表面抗原进行染色。加入固定/破膜细胞液200μL，4℃放置20 min，实验管分别加入FITC标记的抗IFN-γmAb、PE标记的抗 IL-4 mAb，4℃避光孵育30 min后，用1 mL Perm/Wash液洗涤2次，最后以300μL PBS重悬细胞，24 h内采用流式细胞仪检测分析，用Cellsquest软件获取并分析数据。

1.7 统计学处理 应用SPSS 11.0进行分析，各组大鼠关节炎指数，抗CⅡ抗体A值，Th1、Th2型细胞及其比率比较采用单因素方差分析，组间的两两比较用SNK-q法进行。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组大鼠关节炎指数、CIA发生率以及其外周血抗CⅡ抗体水平比较 正常对照组大鼠关节炎指数为0，其他3组各指标比较见表1。

表1 各组大鼠关节炎指数和外周血抗CⅡ抗体A值比较

2.2 4组大鼠外周血CD4+T细胞中Th1和Th2型细胞比例 见表2。

表2 4组大鼠外周血Th1与Th2型细胞的比例

3 讨论

Faunce等［6］用 TGF-β 处理髓磷脂碱性蛋白诱导的APC抑制了实验性自身免疫性脑脊髓炎;Zhang-Hoover等［7］用 TGF-β 处理卵清蛋白诱导的APC阻止了呼吸道过敏。Sundo等［8］利用TGF-β处理、鸡CⅡ诱导的APC抑制了胶原诱导的CIA。该实验使用的抗原是鸡CⅡ的CTE1和CTE2，此2个抗原表位是T细胞识别的关键部位。CTE2(CⅡ中包括260～270氨基酸)是进化上高度保守的片段，在人、牛、鸡等动物中高度同源，CTE1(CⅡ 中包括190～200氨基酸)只在鸡胶原中存在，此串连的抗原肽已经在本实验室纯化成功［4］。该文中使用CTE诱导、TGF-β2刺激的APC一次性尾部注射，不但成功降低了CIA大鼠关节炎的肿胀指数，而且明显减少了血清中的抗CⅡ抗体的浓度，诱导了外周血中Th1细胞向Th2细胞的偏移。抗CⅡ抗体的浓度被认为是反映关节炎复杂程度以及关节软骨破坏的重要指标，血清中抗CⅡ 抗体浓度的高低与炎症因子的浓度高低是正相关的［9-11］。血清中分泌炎症因子的Th1细胞向分泌抗炎性因子的Th2细胞偏移，与作者［9］以前采用CTE喂服CIA大鼠以及使用编码CⅡ蛋白的基因治疗CIA大鼠的效果类似，都是诱导了大鼠对自身CⅡ的耐受。

实验中采用5μg/L TGF-β2作为刺激APC的细胞因子是参考Faunce等［6］所用的浓度，但到底使用多大浓度刺激、处理多长时间能达到最佳效果，也需要进一步探讨。van Duivenvoorde等［12］用牛CⅡ诱导、TNF-α刺激的树突状细胞也抑制了小鼠CIA的发展，并且产生了Th2型的细胞因子，如IL-4、IL-5等，这也说明在使用细胞因子上TGF-β2并非是惟一的刺激因素，也可能有多种未发现的细胞因子，抑或是多种刺激因子共同作用效果会更好。该文中APC是通过CTE诱导、TGF-β2刺激产生的PEC，这种APC是一种混合物，具体是哪种APC(DC、B细胞或者巨噬细胞)参与了耐受的诱导，都需要做进一步分析。

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