不同缺氧状态对人肝癌HepG2细胞侵袭和转移能力的影响*

余桂芳，严跃红，王瑞鑫，曾文铤，朱科伦

(1广州医学院第五附属医院内一科，广东广州510700;2广州医学院第一附属医院肝病研究室，广东广州510120)

原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，大部分肝癌患者就诊时已失去手术机会，经肝动脉化疗栓塞成了主要的治疗措施。然而化疗栓塞后高复发转移影响了患者的预后。多项研究结果表明［1-3］，肝动脉化疗栓塞后残存肿瘤组织微血管密度增加，残存癌细胞侵袭转移能力增强，从而促进肝癌化疗栓塞后的复发转移。因此，探讨缺氧对肝癌细胞侵袭转移能力的影响及其可能机制，为肝癌化疗栓塞程度以及栓塞后抗肿瘤侵袭转移治疗的选择，减少肿瘤复发转移，改善肝癌患者生活质量，延长生命提供实验依据。

材料和方法

1 材料

人肝癌HepG2细胞株由广州医学院微生物免疫教研室提供;24孔 Transwell小室(孔径8 μm)购自Costar;Matrigel及层黏连蛋白购自BD;变异型白细胞分化抗原(CD44v6)兔抗人多克隆抗体来源于武汉博士德生物工程有限公司;即用型免疫组化Biotin-SP-HRP试剂盒购自北京鼎国公司;明胶蛋白购自Amersco;反转录PCR试剂盒购自TaKaRa。

2 方法

2.1 细胞培养 人肝癌HepG2细胞培养于RPMI-1640培养液中(含10%小牛血清，青霉素1×105U/L、链霉素100 mg/L)，将细胞置于CO2细胞培养箱独立密闭小室，充入5%CO2和95%N2混合气体，用测氧仪分别调整氧浓度为1%、3%、5%，分别培养24 h，以常氧培养为对照组。

2.2 MTT法测定人肝癌HepG2细胞对基底膜的黏附能力 不同氧浓度培养24 h后的HepG2细胞，用胰酶消化为单细胞悬液，台盼蓝染色后计数。将matrigel包被96孔板，2%BSA封闭。细胞悬液加入包被好的96孔板中，作用30 min、60 min、90 min和120 min后吸出培养液及未黏附细胞，每孔加入5 mg/L MTT 20 μL，用酶标仪于波长570nm处测定各孔吸光度值(A值)，以A值代表黏附细胞数，按下列公式计算细胞黏附率及黏附抑制率:黏附率=(黏附前细胞A值-黏附后细胞A值)/黏附前细胞A值×100%;黏附抑制率=(对照组细胞黏附率-处理组细胞黏附率)/对照组细胞黏附率×100%。

2.3 Transwell小室观察人肝癌细胞侵袭及游走能力 将人工基底膜Matrigel按上法稀释后，每室100 μL均匀铺于小室腔膜上，成胶后于小室滤膜下面均匀涂上5 μg层黏连蛋白，放进24孔板中，紫外线照射2 h。实验前以预热的无血清培养基37℃水化90 min后去除培养基，将上述单细胞悬液加入其中。不同条件下孵育箱培养24 h;取出各组Transwell小室，无水乙醇固定，HE染色，中性树胶封片后光镜下观察(10×20)5个视野穿膜细胞数，计算平均每个视野细胞。游走实验与侵袭实验相似，仅在Transwell小室腔上不铺Matrigel。

2.4 免疫细胞化学染色(biotin-SP-HRP染色法)检测HepG2细胞CD44v6的表达 不同氧浓度处理的HepG2细胞，按常规方法免疫细胞化学染色，方法参照免疫组化试剂盒说明进行。CD44v6主要表达于细胞膜与细胞浆中，其阳性表达以细胞质及质膜出现明显的黄棕色颗粒状沉积为准。排除爬片边沿细胞。10×10低倍镜下随机选取10个细胞分布均匀的视野，每视野10×20倍镜下随机计数50个细胞。按细胞着色强弱分为4个等级:无着色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分。按公式HSCORE=∑Pi(i+1)(i=0，1，2，3;Pi表示评分为 i的比例)计算爬片H-SCORE得分。该评分方法较具体、真实地从总体水平反映细胞内蛋白表达的情况。阳性率=(1+2+3)细胞数/总细胞数×100%。

2.5 胶质酶谱分析 上述处理后的细胞使用常规方法抽提细胞总蛋白，并进行蛋白定量。明胶酶谱分析按传统方法:上样含1 g/L明胶的10%SDSPAGE凝胶电泳，0.5%考马斯亮蓝染色，脱色。凝胶经图像分析软件成像分析，读取图像反转模式后各消化条带的灰色度及其面积。

2.6 RT－PCR 上述处理后的细胞按常规方法用trizol试剂提取细胞总RNA，然后进行一步法反转录PCR反应。PCR引物序列如下。低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor 1 alpha，HIF-1α):上游引物5'-GCTCCCTATATCCCAATGGAT-3'，下游引物5'-CCATCATGTTCCATTTTTCGC-3'，产物长度 491 bp。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF):上游引物 5'-ACATCTTCCAGGAGTACCCTGATGAG-3'，下游引物 5'-GCATTCACATTTGTTGTGCTGT-3'。β-actin:上游引物5'-ACACTGTGCCCATCTACG-3'，下游引物5'-CTCGTCATACTCCTGCTTG-3'。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，扫描图像进行密度分析，分别以各目的基因电泳条带总灰度值与β-actin电泳条带总灰度值之比进行统计学分析。

3 统计学处理

结 果

1 缺氧对HepG2细胞黏附能力的影响

由表1可见，随着HepG2细胞对Matrigel作用时间的延长，细胞黏附率增加。相同作用时间，经低氧处理后HepG2细胞的黏附率也增高，其中3%氧处理后HepG2细胞的黏附率增高最为明显，60 min达最高黏附抑制率-33.9%，与对照组比较均有统计学意义(P＜0.01);与对照组比较，5%氧处理组的黏附能力也显著增强(P＜0.05)，而1%氧处理组差异无统计学意义(P＞0.05)。

表1 不同浓度氧处理HepG2细胞的黏附率变化Table 1.Adhesion rates of the HepG2 cells exposed to different concentrations of oxygen examined by MTT assay(%.±s.n=5)

表1 不同浓度氧处理HepG2细胞的黏附率变化Table 1.Adhesion rates of the HepG2 cells exposed to different concentrations of oxygen examined by MTT assay(%.±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.The inhibitory rates were given in parenthesis.

.66±2.88 1%O2 25.91±2.01(3.42)Group 30 min 60 min 90 min 120 min Control 26.83±2.31 46.58±2.34 67.53±2.78 82 82.83±2.31(-0.20)3%O2 36.46 ±2.10＊＊(-35.9)44.29±2.45(4.91)66.33±2.59(1.78)92.07 ±2.44＊＊(-11.4)5%O2 31.71±2.34*(-18.2)62.37 ±2.51＊＊(-33.9)85.69 ±2.52＊＊(-26.9)54.28 ±2.31＊＊(-16.5)76.43 ±2.46＊＊(-13.2)87.66±2.78*(-6.0)

2 缺氧对HepG2细胞穿透基底膜与迁移能力的影响

由图1、2可见，低氧处理后，迁移和穿透基底膜的HepG2细胞数增多。与对照组比较，3%氧处理组和5%氧处理组穿透基底膜及迁移的细胞均显著增加(P＜0.05，n=5)，而1%氧处理后无显著差异(P ＞0.05)，见表2。

3 CD44v6表达变化

HepG2细胞中CD44v6阳性信号主要位于细胞膜与细胞浆内，呈黄棕色颗粒沉积，见图3，常氧状态下培养的HepG2细胞CD44v6阳性率为(91.70±0.55)%，H-SCORE得分为 2.85±0.06，见表 3。不同浓度氧处理后，仅3%和5%氧处理组表现为H-SCORE和阳性率增高(P＜0.01，n=5)，以3%氧处理组最为显著。与对照组比较，1%氧处理组CD44v6阳性率和H-SCORE稍微下降，但无显著差异(P＞0.05)。

Figure 1.Effects of different concentrations of oxygen on metastasis ability of HepG2 cells(HE staining，×100).A:control;B:1%oxygen;C:3%oxygen;D:5%oxygen.图1 不同浓度氧对HepG2细胞游走迁移的影响

Figure 2.Effects of different concentrations of oxygen on invasion ability of HepG2 cells(HE staining，×100).A:control;B:1%oxygen;C:3%oxygen;D:5%oxygen.图2 不同浓度氧对HepG2细胞穿透基底膜的影响

4 MMP－9与MMP－2的表达变化

如图4所示，各组均可见2个主要条带，根据分子量大小分别鉴定为MMP-9和MMP-2。根据灰度值分析，3%和5%氧处理组MMP-9和MMP-2的表达显著增高(P＜0.05，n=5)，而1%氧处理组未见显著差异(P＞0.05)。

Figure 3.Changes of the expression of CD44v6 in HepG2 cells after treated with different concentrations of oxygen(immunostaining，×400).A:control;B:1%oxygen;C:3%oxygen;D:5%oxygen.图3 不同缺氧状态下人肝癌细胞CD44v6表达的变化

表2 不同浓度氧处理后穿透基底膜与游走迁移的细胞数Table 2.Numbers of invasive cells and migration cells after exposed to different concentrations of oxygen in the Transwell migration assays(±s.n=5)

表2 不同浓度氧处理后穿透基底膜与游走迁移的细胞数Table 2.Numbers of invasive cells and migration cells after exposed to different concentrations of oxygen in the Transwell migration assays(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group Migratory cells Invasive cells Control 99±2 80±9 1%O2 101±9 83±9 3%O2 134 ±9＊＊ 123 ±8＊＊5%O2 118±9* 99±10*

表3 CD44v6蛋白在HepG2细胞中的H－SCORE评分Table 3.The H-SCORE and the positive rate of CD44v6 in HepG2 cells(±s.n=5)

表3 CD44v6蛋白在HepG2细胞中的H－SCORE评分Table 3.The H-SCORE and the positive rate of CD44v6 in HepG2 cells(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.

Group H-SCORE Positive rate(%)Control 2.85±0.46 91.70±1.51 1%O2 2.79±0.45 91.01±1.62 3%O2 3.54 ±0.39* 97.33 ±1.54＊＊5%O2 3.21±0.42 94.67±1.58*

5 HIF－1α和VEGF的表达变化

不同氧处理后应用反转录PCR检测HIF-1α和VEGF的转录水平。根据灰度密度的统计学分析，3%和5%氧处理组HIF-1α和VEGF的表达显著增高(P＜0.05，n=5)，而1%氧处理组未见显著差异(P＞0.05)，见图5。

讨 论

Figure 4.Changes of the expression of MMP-9 and MMP-2 in cultured HepG2 cells after treated with different concentrations of oxygen(gelatin zymography).C:control;1，2，3:1%，3%and 5%oxygen treatment group，respectively.±s.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.图4 不同浓度氧处理HepG2细胞后MMP－9和MMP－2表达

缺氧是实体瘤微环境的基本特征之一［4］，同时也是肿瘤发生恶性转化甚至转移的启动因素。早有研究表明低氧可增加肿瘤细胞侵袭和转移。由于肿瘤内血管结构和功能异常所致的肿瘤细胞血供、氧供减少以及肿瘤细胞的快速增殖所致的肿瘤细胞氧耗增加，引起肿瘤细胞发生恶性转化，促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移等恶性生物学行为，导致了肿瘤细胞的遗传不稳定性和恶性的选择。原发性肝癌以生长迅速为特征，缺氧在肝癌细胞内部尤其是巨块型肝癌非常常见，肝动脉化疗栓塞加重肿瘤内部细胞缺氧的程度，残存的缺氧肿瘤细胞可能改变其侵袭转移特性。本实验采用不同的低氧条件处理肝癌细胞24 h，研究肿瘤细胞的各项特性和相关蛋白的表达变化。结果证实了低氧应激使肿瘤细胞的黏附、穿透基底膜以及运动能力发生了不同程度的改变，其中以3%氧对肝癌细胞影响最大，其黏附能力、穿透基底膜以及运动能力均明显增强，而1%氧反而降低肝癌细胞的黏附能力、运动能力以及穿透基底膜能力。该体外实验结果提示适度缺氧不但不能杀死肿瘤细胞，反而可能促进肿瘤细胞的表型改变，导致侵袭和转移能力的增强。从临床应用角度，该结果提示肝动脉化疗栓塞可能给肝癌患者复发转移提供了条件。由于肝癌组织的氧大部分来自肝动脉，但也有一部分来自门静脉，在肝动脉化疗栓塞后是否联合门静脉栓塞值得进一步探讨和研究。

Figure 5.Changes of the expression of HIF-1α and VEGF in HepG2 cells after treated with different concentrations of oxygen(RT-PCR).C:control;1，2，3:1%，3%and 5%oxygen treatment group，respectively.±s.n=5.*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group.图5 不同浓度氧处理HepG2细胞后HIF－1α和VEGF的转录水平

肿瘤细胞对基底膜的黏附是实现肿瘤细胞侵袭转移的第一步，其黏附过程借助细胞膜上的黏附因子，其中CD44是目前研究较多的一种细胞黏附分子。它能与透明质酸等多种配体分子结合，介导细胞与细胞间、细胞与细胞外基质的黏附，通过黏附、迁移、渗透、信号转导等促进肿瘤细胞的侵袭和转移。CD44v6是最早被发现的含有变异型外显子v6编码序列的CD44分子，不少研究提示CD44v6可促进肿瘤细胞黏附与运动能力［5-6］。本实验采用免疫细胞化学技术检测了不同低氧应激后肝癌细胞CD44v6表达的改变，结果显示随着氧浓度的减少，CD44v6的表达先增高后降低，其中3%氧对肝癌细胞的影响最大，1%氧处理后CD44v6的表达反而有所降低，提示适度的缺氧可上调CD44v6在肝癌细胞的表达。已有体外实验显示CD44v6参与了癌细胞与基底膜主要成分laminin和Ⅳ型胶原的黏附，其促进肿瘤侵袭转移可能与其促进了肿瘤细胞与血管内皮细胞、基底膜的黏附作用，同时提高了肿瘤细胞的迁移运动能力有关［5，7］。由此可见经低氧应激后人肝癌细胞对基底膜的黏附能力、穿透基底膜以及迁移运动能力的改变可能与CD44v6的表达改变有关。

此外，低氧在诱导肿瘤转移前微环境形成中也有多种细胞因子参与［8］。已有多项研究表明，缺氧肿瘤细胞侵袭和转移能力的改变可能与HIF-1α表达的增加密切相关，后者上调VEGF、MMP-9、MMP-2等转移相关因子的表达［9-10］。这些因子由低氧诱导，如HIF-1α和VEGF，在远端转移前，器官依次诱导炎症因子和基质金属蛋白酶表达，从而创造了一个易于使肿瘤细胞进入的良好环境，并改变了肿瘤细胞的侵袭和转移能力［11］。本研究就HIF-1α、VEGF、MMP-9、MMP-2等肿瘤侵袭转移相关因子，观察不同缺氧程度下这些相关因子的表达变化。结果显示与侵袭转移能力的改变相平行，上述因子均表现为中度缺氧(3%氧)时表达上调，推测缺氧相关的肿瘤细胞侵袭力改变可能通过HIF-1α途径上调下游转移相关因子VEGF、MMP-9和MMP-2的表达，增强肿瘤细胞穿透基质、运动等侵袭转移能力。肿瘤细胞即使在氧供应充分时，也以糖无氧酵解形式获取能量，在低氧环境下，这种糖酵解能力增强，进而导致线粒体功能障碍，产生更多中间代谢产物(如丙酮酸等)，后者可被肿瘤细胞利用以合成转移相关因子及核酸等，从而促进肿瘤的生长［12］。因此，通过寻求一个合理靶点调控这一相关信号转导通路，降低MMPs的分泌和表达，有望降低因缺氧导致的肿瘤细胞侵袭能力增强，对肝癌的防治可能具有重大意义。但肿瘤细胞的侵袭和转移是个复杂的多步骤过程，其中包括多种转移相关因子表达的改变［13-14］，缺氧状态下肝癌细胞侵袭和转移能力改变的机制还有待进一步阐明。

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