当归补血汤对动脉粥样硬化兔内皮祖细胞及血清VEGF、SDF－1的影响*

秦 臻， 黄水清

(广州中医药大学，广东广州510405)

动脉内皮细胞的损伤和功能失调是动脉粥样硬 化(atherosclerosis，AS)发生发展的关键因素，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)在血管内皮损伤再生和修复中起着主要作用，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及基质细胞衍生因子1(stromal cells derived factor 1，SDF－1)在EPCs的调节机制中具有重要作用。当归补血汤(Danggui Buxue decoction，DBD)具有较好的调血脂和抗氧化作用[1]，并能抑制相关炎症因子来保护AS中受损血管内皮。本文将探讨当归补血汤对AS病程中EPCs的相关影响及可能作用机制。

材料和方法

1 主要试剂与仪器

M199培养液(M199 medium，Gibco)，胎牛血清(PAA)，淋巴细胞分离液(天津灏洋生物科技有限公司)，FITC标记荆豆凝集素1(FITC－labeled Ulex europaeus agglutinin，FITC － UEA －1，Sigma)，DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI－labelled acetylated low－density lipoprotein，DiI－ac－LDL，Invitrogen)，血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF，PeproTech)，碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF，PeproTech)，Transwell小室(Corning)，体外血管生成试剂盒(Corning)，辛伐他汀(杭州默沙东公司)，荧光显微镜(Leica)。

2 方法

2.1 制备当归补血汤水煎液 药材经广州市药检所鉴定为道地药材，按原方中黄芪(甘肃)和当归(甘肃)5∶1配伍比例称取生药，每克生药加水6 mL浸泡30 min，煮沸后再文火慢煎40 min，趁热过滤，滤液自然滴尽，二煎每克生药加水4 mL，煎法同前，合并滤液，60℃水浴浓缩成含1 kg/L生药的水煎液。密封，－20℃保存备用。

2.2 模型复制[2]新西兰兔10只，雌雄各半，由广州中医药大学动物中心提供，合格证号为0014280，体重2.0～3.0 kg，普通饲料喂养1周后分为2组，每组5只。正常组予以普通饲料喂养，模型组予以牛血清白蛋白(250 mg/kg)一次性耳缘静脉注射，每天喂以每2 kg含1 g胆固醇的高脂饲料，连续4周后空气栓塞处死动物，取主动脉弓部，HE染色，观察主动脉动脉粥样硬化斑块情况;并于心脏房室沟直下方每隔0.3 cm 作一横切面，共切3块，每块厚约0.25～0.3 cm，均作脂肪染色。动脉粥样硬化按管腔阻塞程度分为4级:斑块阻塞管腔在25%以下者为1级，斑块阻塞管腔在25% ～50%者为2级，斑块阻塞管腔在51%～75%者为3级，斑块阻塞管腔在75%以上甚至使管腔完全闭塞者为4级。

2.3 动物分组及取材 新西兰兔25只，雌13、雄12只，广东省实验动物中心提供，合格证号为0072402，体重1.8 ～2.2 kg，全部动物按2.2 方法造模结束后，按体重随机分为模型组、辛伐他汀组、当归补血汤高、中、低剂量组，每组5只。按动物与人等效剂量折算，当归补血汤高、中、低剂量分别予以当归补血汤 6 g/kg、3 g/kg、1.5 g/kg 灌胃，辛伐他汀组予以辛伐他汀水悬液1.7 mg/kg，模型组予以等量蒸馏水，灌胃2周，每周测体重1次以调整给药剂量。灌胃结束禁食12 h后，腹腔麻醉动物，腹主动脉采血，真空负压管采取6 mL新鲜血及30 mL EDTA抗凝血。

2.4 EPCs的培养 抗凝血用PBS按1∶1稀释，稀释后的抗凝血按1∶1缓慢加入淋巴细胞分离液上层，2 500 r/min离心25 min，吸出单个核细胞层，然后用PBS以1 500 r/min×5 min洗涤2次。用M199全培养基(含 20%FBS，1×105U/L青、链霉素，10 μg/L VEGF和 bFGF)重悬后计数，以 5×109cells/L接种于纤维连接蛋白包被的24孔板中，培养至第4 d换液1次，收集培养第7 d的细胞检测。

2.5 EPCs的鉴定[3]贴壁细胞弃上清，加入含2.4 mg/L DiI－ac－LDL的M199培养液孵育1 h后，PBS浸洗，4%多聚甲醛固定20 min，再加入10 mg/L FITC－UEA－1，孵育1 h后再次用PBS浸洗，避光干燥封片，荧光显微镜下观察细胞吞噬乙酰化低密度脂蛋白及结合荆豆凝集素1的能力。

2.6 增殖能力测定 0.25%胰酶消化收集各组细胞，重悬计数，将等量EPCs接种于96孔板，细胞贴壁后，每孔加入5%MTT 20 μL，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入二甲基亚砜150 μL，振荡10 min，置酶标仪读取A值。实验重复3次。

2.7 黏附能力测定[4]将等量的 EPCs接种于96孔板上，每组设3个复孔，孵育30 min后移去上清及未贴壁细胞，加入PBS，倒置显微镜下随机选取5个视野(×200)计数贴壁细胞。

2.8 迁移能力测定 将等量的EPCs加入Transwell小室的上室，下室加入含50 μg/L VEGF培养基，培养24 h，棉签擦去上室中的细胞，4%多聚甲醛固定，吉姆萨染色，倒置显微镜下随机选择5个视野(×200)计数迁移至下层的细胞。实验重复3次。

2.9 形成小管能力测定 将ECMatrix胶液和ECM 10×稀释液置于4℃冰箱过夜，使之融化。每900 μL ECMatrix胶液加入 ECM 10×稀释液100 μL，将混匀液加入96孔板，每孔50 μL，孵育1 h凝固成胶，将各组细胞以5 000 cells/well接种于胶上，每组设3个复孔，37℃培养24 h后，倒置显微镜每孔随机选取5个视野(×200)计数长度为宽度4倍以上的细胞。

2.10 ELISA法检测VEGF及SDF－1 6 mL兔血室温静置2 h，以3 000 r/min离心15 min后取上清，按试剂盒说明操作检测，每个样本重复3次，取平均值。

3 统计学处理

结 果

1 动物模型复制

正常家兔主动脉内膜等结构完整，内皮下无脂质沉积或斑块形成，心脏切片均未发现冠状动脉粥样硬化斑块;模型组主动脉内膜增厚，形成明显的粥样斑块，可见大量泡沫细胞，心脏切片均可见到冠状动脉内膜有粥样硬化斑块形成，斑块经油红O染色证实是大量脂质沉着，脂肪染色管腔阻塞程度模型组为2级或3级，见图1。

Figure 1.The pathological sections of rabbit coronary artery(oil red O staining，×200).A:control group;B:AS group.图1 兔冠状动脉病理切片

2 EPCs的鉴定

贴壁细胞经DiI－ac－LDL和FITC－UEA－1处理后，荧光显微镜下DiI－ac－LDL和FITC－UEA－1双染色阳性细胞为正在分化的EPCs，见图2。

Figure 2.Identification of EPCs(×200).A:adherent cells with DiI－ac－LDL(red);B:cells binding FITC－UEA－1(green);C:double positive cells were differentiating EPCs.图2 EPCs的鉴定

3 当归补血汤对兔EPCs功能及血清VEGF、SDF－1表达的影响

汤高剂量组及中剂量组间作用效果无明显差异，见表1、图3。

与模型组比较，当归补血汤高、中剂量组及辛伐他汀组兔血清VEGF和SDF－1浓度水平增高(P＜0.05)，且EPCs增殖、黏附、迁移和形成小管能力均有增强(P＜0.05)，低剂量组血清VEGF、SDF－1浓度及EPCs功能无明显变化;辛伐他汀组、当归补血

讨 论

动脉血管内皮的损伤与修复始终贯穿于AS病程，内皮细胞的损伤和功能失调是AS形成最重要的一步，内皮在修复与损伤间的动态变化，将最终决定着AS的病变发展，因此内皮再生显得尤为重要。研究发现[5－8]EPCs可参与血管内皮损伤后的再生与修复，EPCs活性维持在高水平可渐弱多重危险因素的致AS作用。然而，EPCs的数量及功能却在AS相关疾病中受到明显损害:在确诊的冠心病患者中发现其EPCs的数量和非老化EPCs的数量显著减少，并与冠状动脉粥样钙化积分和股动脉中膜厚度呈负相关，进一步发现EPCs的数量和活性在稳定的冠心病患者中与冠脉的狭窄程度密切相关，提示EPCs的数量降低和活性抑制加速AS进展。因此，通过移植正常功能或基因修饰的EPCs，或通过改善循环血中EPCs的数量及功能来修复内皮一直是近年研究的热点。

表1 当归补血汤对兔EPCs功能及血清VEGF、SDF－1水平的影响Table 1.Effects of DBD on functions of EPCs and serum levels of VEGF and SDF－1(±s.n=5)

表1 当归补血汤对兔EPCs功能及血清VEGF、SDF－1水平的影响Table 1.Effects of DBD on functions of EPCs and serum levels of VEGF and SDF－1(±s.n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs AS group.

Group VEGF(ng/L) SDF－1(μg/L) Proliferation(A) Adhesion(cells，×200) Migration(cells，×200)Angiogenesis(cells，×200)AS 27.98±16.22 2.01 ±0.48 0.19 ±0.07 132.7 ±37.8 217.0±35.9 11.0±2.2 Simvastatin 64.96±15.23* 2.96±0.39* 0.30±0.09* 249.6±78.3* 373.8±33.3＊＊ 19.6±4.2*High－dose DBD treatment 61.28±21.87* 2.84±0.42* 0.28±0.04* 224.9±75.4* 283.2±52.0* 16.8±4.7*Middle－dose DBD treatment 61.36±20.90* 2.71±0.46* 0.30±0.10* 232.4±39.4* 278.8±18.1* 16.6±6.2*Low －dose DBD treatment 34.45±11.03 2.23±0.41 0.22±0.05 152.4±43.1 232.6±38.9 8.6±2.1

Figure 3.Angiogenesis of EPCs in vitro(×100).A:tubule number is small in AS group;B:low －dose DBD treatment group;C，D，E:tubule number increased in middle－dose of DBD，high－dose of DBD and simvastatin groups.Obvious tube－like structure formation was found in D and E.图3 EPCs的体外形成小管能力

AS作为一种缓慢发展的血管内膜炎性病变，其中医主要病机为气血不足，血脉瘀阻。当归补血汤由黄芪5份及当归1份组成，是益气活血的经典名方，已证实具有良好的血管内皮保护作用，能明显改善兔AS模型主动脉粥样硬化斑块的面积及厚度[1]，可同时调控NF－κB及p38MAPK信号通路来抑制相关炎症因子对内皮的损伤[9－10]。由于AS发展中存在着EPCs的耗竭，导致EPCs依赖性的动脉内皮缺乏修复，从EPCs这一角度来阐述当归补血汤的内皮保护作用，将作为其保护机制的重要补充，并为临床应用提供更有力的理论依据。

研究表明家兔EPCs数量及功能在AS病理状态下均受到严重损害[11]，辛伐他汀[12]及益气活血方药补阳还五汤[13]均可明显改善正常家兔外周血EPCs的功能，促进EPCs的分化。本文对AS病理状态下EPCs进行研究，结果显示当归补血汤及辛伐他汀均可保护AS中受损的EPCs相关功能，同时也初步探讨了其可能作用机制:VEGF和SDF－1在EPCs的调节中具有重要作用[14－15]，内皮损伤后释放的VEGF和SDF－1分别与EPCs表面的特异性受体VEGF－R1、VEGF－R2和CXCR－4结合，诱导EPCs的增殖;而释放的SDF－1能在骨髓和受损内皮间形成一个由高到低的浓度梯度，使EPCs逆着SDF－1浓度梯度到达受损内皮;VEGF亦可引起受损缺血部位EPCs的聚集，促进血管新生，同时 SDF－1和VEGF也是影响EPCs向内皮细胞分化的主要因子。研究表明当归补血汤及辛伐他汀组兔血清VEGF、SDF－1较模型组维持在较高水平，这提示当归补血汤可能通过维持循环VEGF和SDF－1水平来参与EPCs活性的调控，但这仍需进一步体外研究验证。

尽管他汀类药物能在短时间内动员EPCs修复损伤内皮，但长时间药物治疗可导致 EPCs的枯竭[16]，长时间应用当归补血汤是否也会有同种弊端，益气活血方药能否稳定有效地维持EPCs的活性仍值得进一步探究。

[1]黄水清，王 斌，王 剑，等.当归补血汤抗家兔动脉粥样硬化形成的实验研究[J].北京中医药大学学报，2005，28(5):38 －40.

[2]汪 谦 主编.现代医学实验方法[M].第1版.北京:人民卫生出版社，1998.955 －956.

[3]Vasa M，Fichtlscherer S，Adler K，et al.Increase in circulating endothelial progenitor cells by statin therapy in patients with stable coronary artery disease[J].Circulation，2001，103(24):2885 －2890.

[4]George J，Herz I，Goldstein E，et al.Number and adhesive properties of circulating endothelial progenitor cells in patients with in － stent restenosis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(12):e57 － e60.

[5]崔 斌，黄 岚，武晓静，等.内皮祖细胞移植对血管内膜修复的影响[J].中国病理生理杂志，2007，23(4):625－628.

[6]Lev EI，Leshem －Lev D，Mager A，et al.Circulating endothelial progenitor cell levels and function in patients who experienced late coronary stent thrombosis[J].Eur Heart J，2010，31(21):2625 －2632.

[7]Wang HY，Gao PJ，Ji KD，et al.Circulating endothelial progenitor cells，C－reactive protein and severity of coronary stenosis in Chinese patients with coronary artery diseases[J].Hypertens Res，2007，30(2):133 － 141.

[8]Hughes AD，Coady E，Raynor S，et al.Reduced endothelial progenitor cells in European and South Asian men with atherosclerosis[J].Eur J Clin Invest，2007，37(1):35 －41.

[9]孙 娟，黄水清，马文静，等.当归补血汤对ox－LDL激活RAW264.7细胞核转录因子－κBp65蛋白表达的影响[J].北京中医药大学学报，2009，32(9):608 －610，648.

[10]黄水清，沈小燕，韩 凌，等.当归补血汤含药血清对ox－LDL激活单核细胞p38 MARK的作用[J].中药新药与临床药理，2010，21(5):458 －461.

[11]李 蕾，张怀勤，尹 娟，等.黄芪对动脉粥样硬化兔骨髓内皮祖细胞生长的影响[J].实用医学杂志，2011，27(7):1154－1156.

[12]周丽昉，康治臣，高长斌.辛伐他汀对兔外周血内皮祖细胞增殖、迁移、黏附能力的影响[J].中国老年学杂志，2011，31(8):1387 －1389.

[13]刘 锟，李 坤，董国华，等.补阳还五汤对外周血内皮祖细胞数量和功能的影响[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15(6):1044 －1049.

[14]Lapidot T，Dar A ，Kollet O.How do stem cells find their way home?[J].Blood，2005，106(6):1901 －1910.

[15]Hristov M，Erl W，Weber PC.Endothelial progenitor cells:mobilization，differentiation，and homing[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2003，23(7):1185 －1189.

[16]Hristov M，Fach C，Bcker C，et al.Reduced numbers of circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease associated with long－term statin treatment[J].Atherosclerosis，2007，192(2):413－420.