过氧化物酶体增殖物激活受体δ对同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞MCP－1 mRNA表达的影响及机制*

宋欢欢， 徐尚华△， 黄茂芝， 许昌声， 谢良地

(1福建医科大学附属南平第一医院心内科，福建南平353000;2福建省高血压研究所，福建福州350004)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种炎症性、免疫性疾病。单核细胞趋化蛋白 1(monocyte chemoattractant protein 1，MCP－1)可募集血液中的单核细胞迁移至内膜下，同时促进血管内膜炎性反应，参与动脉粥样硬化起始过程。研究发现，稳定性心绞痛、血管痉挛、急性冠脉综合症病人血浆MCP－1表达增高;阻断MCP－1可以阻止血管早期炎症反应[1－2]。在动脉粥样硬化、糖尿病等心血管和代谢性疾病中，氧化应激致细胞内ROS表达增高，参与血管炎症过程[3－4]。研究发现，MCP－1的释放加速动脉粥样硬化过程中活性氧的产生[5]。高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia，HHcy)是AS的一个新的独立危险因素。研究表明，AS患者血清Hcy水平明显高于正常人，且与病情的严重程度呈正相关[6－7]。过氧化物酶体增殖物激活受体 δ(peroxisome proliferator activated receptor δ，PPARδ)是一类依赖配体激活的核激素受体，属于类固醇受体超家族。PPARδ不但是脂肪酸代谢的一个重要调节者，而且研究发现其在炎症、动脉粥样硬化中也发挥重要作用[8－10]。本研究通过观察 PPARδ 激活后对Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)表达MCP－1的影响并探讨其机制。为动脉粥样硬化，尤其是伴有高同型半胱氨酸血症的动脉粥样硬化等心血管和代谢紊乱疾病提供潜在的治疗靶点。

材料和方法

1 主要试剂及仪器

M199细胞培养基、胎牛血清、0.1%Ⅰ型胶原酶、0.25%胰酶－EDTA(Gibco);二氧化碳培养箱(Napco);倒置相差荧光显微镜(Olympus);Hcy、GW0742、DPI干粉(Sigma);RT－PCR试剂盒、Tag酶(Fermentas);Trizol试剂、琼脂糖(Invitrogen);PPARδ抗体(Abcam);β－actin抗体(Santa Cruz);辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG(中杉金桥公司);vWF抗体(Dako);山羊抗兔IgG－R(Santa Cruz);活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)检测试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司);硝酸纤维素膜(Millipore);紫外分光光度计(上海仪器厂);PCR扩增仪(Bioneer);高速低温离心机(Beckman);系列凝胶成像系统(Vilber Lourmat);水平琼脂糖电泳槽、DYCZ－24DN型 双垂直电泳仪、DYCP－40C型半干式碳板转印仪和DYY－III－6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂)。

2 方法

2.1 细胞消化及培养 在无菌条件下，取健康产妇剖宫产后新鲜的胎儿脐带15～20 cm(标本来自福建医科大学附属第一医院)，低温保存于M199培养基中，4 h内进行细胞消化分离。采用胶原酶消化法分离HUVECs，于超净台内在脐静脉一端插入16号针头并以止血钳固定，用37℃预热的PBS冲洗至无血迹，用另一把止血钳夹住脐带的另一端，注入预热的0.1%Ⅰ型胶原酶10～15 mL至脐静脉充盈饱满，室温消化15 min;用不含FBS的M199培养液冲洗1遍，将消化液收集入15 mL无菌离心管，1 500 r/min离心10 min;弃上清，用含20%FBS的M199完全培养液吹打成细胞悬液，在37℃、5%CO2培养箱培养。根据细胞生长情况每2～3 d换液，用第2代或第3代细胞进行实验。

2.2 细胞鉴定 取1代细胞进行细胞爬片，待细胞铺满80%左右，PBS洗涤3次;用4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤3次;在含0.5%Triton X －100的PBS中孵育20 min，PBS洗涤3次;1%BSA室温封闭30 min，Ⅰ抗37℃孵育1 h，PBS洗涤3次;Ⅱ抗37℃孵育1 h，PBS洗涤3次;荧光显微镜下观察。

2.3 实验分组 取2～3代细胞接种于6孔培养板，待细胞铺满80%左右，换用优化培养基培养24 h使细胞同步化，实验分为对照组、Hcy组、GW0742(PPARδ特异激动剂)组和二亚苯基碘鎓(diphenyleneiodonium，DPI，NAPDH 氧化酶特异抑制剂)组;先加入 GW0742(终浓度 10－6mol/L)、DPI(终浓度10－5mol/L)，30 min 后加入 Hcy(终浓度 10－3mol/L)作用24 h后处理细胞(每次实验每组设2个复孔，实验重复5次)。

2.4 RT－PCR检测目的基因 采用Trizol试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测浓度后，按RT－PCR说明书操作逆转录为cDNA，后加PCR Mix及相应引物扩增MCP－1、PPARδ及GAPDH。MCP－1上游引物5'－ATGAAAGTCTCTGCCGCC －3'，下游引物 5'－TTGCTTGTCCAGGTGGTC －3'，290 bp;PPARδ 上游引物 5'－ACGCTATCCGTTTGGTCG －3'，下游引物 5'－CTCACGGGTGACAAAGCC －3'，524 bp;内参照(GAPDH)上游引物5'－ACCACAGTCCATGCCATCAC － 3'，下游引物 5'－ TCCACCACCTGTTGCCTGTA －3'，454 bp。反应条件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，30 个循环，72 ℃10 min;PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统分析其吸光度值，目的基因和内参照的吸光度比值作为mRNA的相对表达量。

2.5 Western blotting检测 PPARδ蛋白表达 以预冷PBS洗涤干预细胞2次，添加了PMSF和蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液于冰上裂解细胞5 min，用细胞刮刮下细胞并收集至1.5 mL的离心管中，超声振荡，按上样缓冲液和蛋白4∶1混合，100℃水浴5 min;12 000 r/min离心5 min，取上清－80℃冰箱保存。经电泳、转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h;加入Ⅰ抗4℃过夜，TBST洗膜3次，每次10 min;再加HRP标记的Ⅱ抗37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;发光剂ECL盒显色反应。用凝胶图像分析所得电泳图的平均吸光度值。

2.6 细胞内ROS初级荧光测定 用24孔培养板干预细胞，按 ROS检测试剂盒说明，取 130 μL Genmed染色液(Reagent B)至15 mL离心管，加入12.870 mL Genmed稀释液(Reagent C)，混匀后，标记为Genmed染色工作液，避光37℃保存;然后抽去24孔板中的细胞培养液，沿着孔壁各孔加入500 μL Genmed染色工作液，37℃细胞培养箱里孵育20 min;抽出Genmed染色工作液，沿着孔壁各加入500 μL 37℃预热的 Genmed 保存液(Reagent D)，倒置荧光显微镜观察，拍照。用Image－Pro Plus对荧光图片进行分析，计算吸光度，吸光度越高，表明细胞内ROS水平越高。以空白对照组的吸光度为基准值(100)，计算每组细胞的ROS相对水平。

3 统计学处理

结 果

1 HUVECs 鉴定

vWF因子免疫荧光发现细胞质激发出红色荧光，即呈阳性反应，见图1。

Figure 1.Red fluorescence was observed in the cytoplasm of HUVECs under fluorescent microscope(×400).图1 荧光显微镜下HUVECs细胞质激发出红色荧光

2 Hcy对人脐静脉内皮细胞MCP－1 mRNA表达的影响

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈浓度依赖性促进人内皮细胞 MCP－1 mRNA表达，Hcy浓度为10－5mol/L时，与空白对照组相比，MCP－1 mRNA表达水平显著增高(P＜0.01)，见图2。

Figure 2.Effect of Hcy on the mRNA expression of MCP－1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.图2 Hcy对HUVECs MCP－1 mRNA表达的影响

3 Hcy对人脐静脉内皮细胞PPARδ mRNA表达的影响

Hcy(10－5～10－3mol/L)呈浓度依赖性降低人内皮细胞 PPARδ mRNA表达，Hcy浓度为 10－5mol/L时，与空白对照组相比，PPARδ mRNA表达显著降低 (P＜0.01)，见图3。

4 GW0742和DPI对Hcy诱导人脐静脉内皮细胞表达MCP－1 mRNA的影响

与空白对照组相比，Hcy组人内皮细胞MCP－1 mRNA表达显著增加(P＜0.01);与Hcy组相比，GW0742组和DPI组人内皮细胞MCP－1 mRNA表达都显著降低(P＜0.01)，见图4。

5 GW0742和DPI对Hcy诱导人脐静脉内皮细胞表达PPARδ mRNA的影响

与空白对照组相比，Hcy组人内皮细胞PPARδ mRNA表达显著降低(P＜0.01);与Hcy组相比，DPI组人内皮细胞PPARδ mRNA表达差异无统计学意义;GW0742组人内皮细胞PPARδ mRNA显著增高(P ＜0.05)，见图5。

Figure 3.Effect of Hcy on the mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10 －6mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －5mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－4mol/L)group;Lane 5:Hcy(10－3mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group.图3 Hcy对HUVECs PPARδ mRNA表达的影响

Figure 4.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of MCP －1 in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;##P＜0.01 vs Hcy group.图4 GW0742和DPI对Hcy诱导HUVECs表达MCP－1 mRNA的影响

6 GW0742和DPI对Hcy诱导人脐静脉内皮细胞表达PPARδ蛋白的影响

与空白对照组相比，Hcy组人内皮细胞PPARδ蛋白表达显著降低(P＜0.05);与Hcy组相比，DPI组人内皮细胞PPARδ蛋白表达差异无统计学意义，GW0742组人内皮细胞PPARδ蛋白表达显著增加(P＜0.05)，见图6。

Figure 5.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced mRNA expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10－3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.图5 GW0742和 DPI对 Hcy诱导 HUVECs表达PPARδ mRNA的影响

Figure 6.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced protein expression of PPARδ in HUVECs.Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10 －6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10－3mol/L)+DPI(10－5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.图6 GW0742和DPI对Hcy诱导HUVECs表达PPARδ蛋白的影响

7 GW0742和DPI对Hcy诱导人脐静脉内皮细胞产生ROS的影响

与空白对照组相比，Hcy组人内皮细胞ROS荧光信号增强;与Hcy组相比，GW0742组和DPI组人内皮细胞ROS荧光信号减弱，见图7。

Figure 7.Effects of GW0742 and DPI on Hcy－induced production of ROS in HUVECs(×400).Lane 1:blank control group;Lane 2:Hcy(10－3mol/L)group;Lane 3:Hcy(10 －3mol/L)+GW0742(10－6mol/L)group;Lane 4:Hcy(10 －3mol/L)+DPI(10 －5mol/L)group.±s.n=5.*P＜0.05 vs blank control group;#P ＜0.05 vs Hcy group.图7 GW0742和DPI对Hcy诱导HUVECs产生ROS的影响

讨 论

血浆Hcy的增高和一些代谢紊乱疾病包括动脉粥样硬化等密切相关。HHcy被认为是AS的一个独立危险因素。陶硕秋等[11]研究发现，Hcy通过NADPH氧化酶介导ROS途径，促进内皮细胞表达血管细胞黏附分子－1(vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1)而参与AS的发病过程。MCP－1募集的单核细胞参与AS的起始过程。研究指出，血液中MCP－1增高可增加冠心病人急性心梗和死亡发生率[12]。本研究发现，Hcy呈浓度依赖性地促进人内皮细胞MCP－1 mRNA表达。Hwang等[13]在高蛋氨酸饲养大鼠发现，大鼠肾脏MCP－1表达增加，同时肾小球硬化增加。由此可见，Hcy引起的MCP－1表达增高在HHcy引起的AS过程中发挥重要作用。

动脉粥样硬化过程中，氧化应激致细胞内ROS表达增高[3]。本实验还发现，Hcy在促进人内皮细胞MCP－1 mRNA表达增高的同时还增加了细胞内ROS的释放，而DPI抑制Hcy促进人内皮细胞MCP－1 mRNA表达和细胞内ROS水平。我们的结果表明，ROS参与Hcy诱导人内皮细胞MCP－1表达的过程。

我们的研究同时还发现，Hcy可抑制人内皮细胞 PPARδ mRNA 和蛋白的表达。Lee 等[14－15]研究发现，糖尿病大鼠炎症因子表达增高的同时，而PPARδ表达下降。此外，我们还发现，PPARδ激活后可以抑制Hcy诱导的人内皮细胞MCP－1 mRNA的表达;Zingarelli等[16]在研究小鼠败血症模型时发现PPARδ表达减弱，而小鼠全身性炎症因子的释放增加，这种反应在应用PPARδ激动剂时得到改善。杨大春等[17]在研究心肌梗死重构大鼠模型时发现，PPARδ激活后可以通过抑制炎症因子基质金属蛋白酶－9表达，从而改善梗死心肌重塑。这表明PPARδ可以通过抑制炎症因子的表达而发挥抗炎作用。我们的研究还发现，PPARδ激活在抑制Hcy诱导的人内皮细胞MCP－1 mRNA表达的同时，降低细胞内ROS水平，而应用DPI也可抑制Hcy诱导人内皮细胞MCP－1mRNA的表达，提示PPARδ激活可能是通过ROS途径抑制MCP－1的表达，从而起到抗动脉粥样硬化作用。而 Fan等[18]研究表明，PPARδ可通过减少细胞内ROS的释放抗氧化应激机制抑制内皮细胞炎性反应。但其具体作用机制仍需更深入的研究。

总之，我们发现，Hcy可以诱导人内皮细胞MCP－1 mRNA的表达及ROS的产生，而PPARδ激活后抑制这些作用，其可能是通过NADPH氧化酶介导的ROS途径发挥抗炎作用。PPARδ有望成为动脉粥样硬化的潜在治疗靶点。

[1]Hung MJ，Cherng WJ，Cheng CW，et al.Comparison of serum levels of inflammatory markers in patients with coronary vasospasm without significant fixed coronary artery disease versus patients with stable angina pectoris and acute coronary syndromes with significant fixed coronary artery disease[J].Am J Cardiol，2006，97(10):1429 －1434.

[2]Inoue S，Egashira K，Ni W，et al.Anti－monocyte che-moattractant protein－1 gene therapy limits progression and destabilization of established atherosclerosis in apolipoprotein E － knockout mice[J].Circulation，2002，106(21):2700－2706.

[3]Griendling KK，FitzGerald GA.Oxidative stress and cardiovascular injury.Part I:basic mechanisms and in vivo monitoring of ROS[J].Circulation，2003 ，108(16):1912－1916.

[4]Park JG，Oh GT.The role of peroxidases in the pathogenesis of atherosclerosis[J].BMB Rep，2011，44(8):497 －505.

[5]Hulsmans M，Holvoet P.The vicious circle between oxidative stress and inflammation in atherosclerosis[J].J Cell Mol Med，2010，14(1 －2):70 －78.

[6]李恒斌，尚士芹.同型半胱氨酸水平与冠心变病患者冠状动脉病变程度相关性研究[J].中国实验诊断学，2009，13(9):1258－1259.

[7]Tribouilloy CM，Peltier M，Iannetta Peltier MC，et al.Plasma homocysteine and severity of thoracic aortic atherosclerosis[J].Chest，2000，118(6):1685 － 1689.

[8]Woo CW，Siow YL，O K.Homocysteine induces monocyte chemoattractant protein－1 expression in hepatocytes mediated via activator protein －1 activation[J].J Biol Chem，2008，283(3):1282－1292.

[9]Wang N.PPAR － δ in vascular pathophysiology[J].PPAR Res，2008，2008:164163.

[10]Bishop－Bailey D，Bystrom J.Emerging roles of peroxisome proliferator－ activated receptor－ β/δ in inflammation[J].Pharmacol Ther，2009，124(2):141 －150.

[11]陶硕秋，徐尚华，巢 毅，等.联合运用晚期糖基化终产物和同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附因子1 mRNA表达及机制[J].中国动脉硬化杂志，2010，18(1):20 －24.

[12]Lemos JA，Morrow DA，Sabatine MS，et al.Association between plasma levels of monocyte chemoattractant protein－1 and long－term clinical outcomes in patients with acute coronary syndromes[J].Circulation，2003，107(5):690－695.

[13]Hwang SY，Woo CW，Au－Yeung KK，et al.Homocysteine stimulates monocyte chemoattractant protein－1 expression in the kidney via nuclear factor－ κB activation[J].Am J Physiol Renal Physiol，2008，294(1):F236 －F244.

[14]Lee TI，Kao YH，Chen YC，et al.Cardiac peroxisomeproliferator－activated receptor expression in hypertension co － existing with diabetes[J].Clin Sci(Lond)，2011，121(7):305－312.

[15]Lee TI，Kao YH，Chen YC，et al.Oxidative stress and inflammation modulate peroxisome proliferator－activated receptors with regional discrepancy in diabetic heart[J].Eur J Clin Invest，2010，40(8):692 －699.

[16]Zingarelli B，Piraino G，Hake PW，et al.Peroxisome proliferator－ activated receptor δ regulates inflammation via NF － κB signaling in polymicrobial sepsis[J].Am J Pathol，2010，177(4):1834 －1847.

[17]杨大春，马双陶，杨永健，等.激活PPARδ对梗死心肌MMP－9及纤连蛋白表达的影响[J].中国病理生理杂志，2010，26(11):2130 －2135.

[18]Fan Y，Wang Y，Tang Z，et al.Suppression of pro－inflammatory adhesion molecules by PPAR－δ in human vascular endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(2):315 －321.