血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因多态性与缺血性卒中的相关性研究☆

龙厚元 代伟 张鲲鹏 宋玉强 谢安木

血小板膜糖蛋白受体P2Y12(platelet membrane receptor P2Y12)在血小板聚集中发挥着特别重要的作用，在动脉血栓形成中起到重要作用[1]。近年来探讨血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因位点多态性与缺血性卒中的相关性已经成为一个重要的研究领域。本项研究检测血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因-T744C位点的多态性与缺血性卒中的相关性，报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组165例相互无血缘关系的缺血性卒中患者，其中男86例，女79例，平均年龄(66.06±7.93)岁。所有患者均为青岛大学医学院附属医院神经内科住院的缺血性卒中患者(入院时间为2011年5月至2012年5月)，并经颅脑CT或MRI检查确诊。纳入标准：符合全国第四届脑血管病会议制定的诊断标准[2]。排除标准：①有心房纤颤的患者；②有外伤手术史的患者；③有血液系统疾病、肿瘤、自身免疫疾病的患者；④有心、肺、肝、肾功能不全的患者。对照组152例，其中男81例，女 71例，平均年龄(64.5± 16.57)岁，均为青岛大学医学院附属医院体检中心同期的健康体检者，并行颅脑CT或MRI排除脑血管疾病。记录临床资料主要包括年龄，性别，高血压，糖尿病，高脂血症。高血压的诊断标准是按照卫生部疾病控制局颁布的《2010年修订版中国高血压防治指南》的规定，并且除外继发性高血压。高脂血症的诊断依据是中国成人血脂异常防治指南制订联合委员会2007年制定的 《中国成人血脂异常防治指南》的诊断标准。糖尿病的诊断依据是美国糖尿病协会颁布的《2010年ADA糖尿病诊疗指南》中的诊断标准。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取方法 病例组和对照组均禁食12 h后抽取外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，溶液型法提取基因组DNA。

1.2.2 聚合酶链反应(PCR-RFLP) 用 Primer-Premiers软件设计扩增-T744c多态位点引物上游5′-TTTGGGGAATTTAAGTGCTAC-3′，下游 5′-CCA-CAATAGGCCTATAATG-3′。引物由美国Invitrogen公司合成。PCR扩增反应体系为10 μL，Tap PCR MasterMix 5 μL，DNA 模板 1.0 μL，上下游引物各0.2 μL，超纯水 3.6 μL。 用 PCR 仪进行扩增，反应条件为 95℃预变性 5 min，95℃变性30 s，58℃退火 36 s，72℃延伸 30 s，共 35个循环，最后 72℃延伸10 min。待PCR反应完成后，取5 μL PCR产物经含溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶电泳系统下确认扩增的252 bp片段为目的产物。

1.2.3 酶切反应 酶切反应体系总量10 μL，用TaiⅠ限制性内切酶 0.5 μL、10X buffer 0.7 μL、PCR 扩增产物3 μL，最后加超纯水至10 μL进行酶切，65℃水浴8 h。经含溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察结果，判断基因型。酶切电泳结果(见图1)，产物是163、89 bp的片段为CC型，252 片段为 TT 型，252、163、89 bp 的片段为 TC型。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，病例组和对照组的计量资料采用(x±s)描述，计量资料数据分析采用方差分析；计数资料数据分析采用卡方检验。采用Logistic回归模型分析影响缺血性卒中的相关因数，检验水准α＝0.05。

图1 T744c酶切后产物

2 结果

2.1 临床资料 病例组和对照组间性别构成、年龄比较差异均无统计学意义(χ2＝0.043，t＝-1.86，P﹥0.05)，但病例组和对照组间高血压、糖尿病、高脂血症比较差异均有统计学意义(χ2＝15.47，χ2＝ 10.29，χ2＝9.17，P﹤0.05或者 P﹤0.01)(见表1)。

表1 病例组与对照组临床资料比较

2.2 基因型和基因型频率 病例组TC／CC基因型频率(43.61%)明显高于对照组的(28.95%)，且差异有统计学意义(χ2＝ 4.73，P﹤0.05)。C 等位基因频率病例组为22.03%明显高于对照组的 15.46%，且差异有统计学意义(χ2＝5.80，P﹤0.05)(见表2)。

2.3 多因素Logistic回归分析 经多因素Logistic回归校正年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症后，以健康对照组为参照系，相对于TT基因型，TC／CC型患缺血性卒中的相对危险度为 1.65，95%CI：1.03～2.75，P＝0.04。

3 讨论

研究证实通过激活Gi信号传导通路可以引起血小板聚集导致血栓形成[3]。Gi信号传导通路主要抑制血小板腺苷酸环化酶的活化，其传导主要由P2Y受体中的 P2Y12受体介导[4]。血小板膜糖蛋白受体P2Y12是ADP受体两个重要的止血及凝血介质之一[3]，在 ADP与 P2Y12受体结合后，P2Y12受体与 Gi蛋白耦连[5]，同时刺激血小板颗粒分泌出血栓素A2，激活纤维蛋白原受体(糖蛋白Ⅱb／Ⅲa受体)，从而使血小板的聚集[6]，因此血小板膜蛋白 P2Y12受体基因多态性可通过影响血小板的功能，导致血栓形成。

表2 病例组与对照组-T744c基因多态性分布频率比较

研究证明血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因参与了敲除小鼠模型凝血机制环节的启动[7]，也有研究推测人类该基因缺陷者凝血机制同样也会出现障碍[8]，国外有研究证实了血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因多态性与动脉血栓的形成有显著的相关性[1]。目前国内外对血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因与血栓性疾病的关系及与氯吡格雷等药物相关性研究较为普遍[9-10]，但于血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因位点多态性作为独立因素影响缺血性卒中的研究仍然不够完善，在缺血性卒中的作用机制仍然需要进一步研究。

本研究结果表明，病例组和对照组间性别构成、年龄比较差异均无统计学意义(P﹥0.05)，而高血压、糖尿病、高脂血症比较差异均有统计学意义(P﹤0.05或者P﹤0.01)。由于CC型基因较少合并与TC型基因组进行统计学分析。病例组TC／CC行基因频率(43.61%)明显高于对照组的(28.95%)，且差异有统计学意义(χ2＝4.73，P﹤0.05)。C等位基因的频率(22.03%)也明显高于对照组的(15.46%)，且差异有统计学意义(χ2＝5.80，P﹤0.05)。经多因素Logistic回归校正年龄、高血压病、糖尿病、高脂血症后，以健康对照组为参照系相对于TT基因型，TC／CC型患脑卒中的相对危险度为1.65。推测血小板膜糖蛋白受体P2Y12基因-T744C位点多态性与缺血性卒中具有相关性，其TC／CC型可能是脑卒中患者易感危险因素之一，其中等位基因C可能是缺血性卒中的致病因子。此外，本研究样本量偏少可能会降低群体的代表性，不同人群的遗传因素也存在差异，这种差异可能导致研究结果存在差异。如果能进行较大样本、多种因素、多项指标的综合分析则能到得更完善的结论。

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