五甲基槲皮素对行颈静脉移植的心肌重构大鼠的治疗作用

毛张凡 徐小惠 黄 杰 耿 庆

1.武汉大学人民医院胸外科，湖北武汉 430060；2.华中科技大学同济医院药剂科，湖北武汉 430030

槲皮素是黄酮类化合物的一种，有广泛的药理学作用，如抗氧化、抗高血压、抗缺血再灌注损伤、抗肿瘤等[1-2]。但天然的黄酮类化合物不易于提取、制备和保存，加之其生物利用度低，半衰期短，效价低，均妨碍了其研发和利用。这些特点是由于其含有多个羟基。而用多甲基替代多羟基结构会使黄酮类化合物具有明显的药代动力学特点和药效动力学优势。但目前天然多甲氧基黄酮由于提取工困难，其使得量少、价格贵，研究仅限于细胞水平而难以进行体内药理学研究。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）是对槲皮素进行了甲基化改造而获得。由于工艺的改进，获得了高纯度、低价位的PMQ，得以体内研究PMQ的药理学特性。

笔者之前的研究发现PMQ除有较强的抗氧化作用外，还有对抗心肌肥厚、纤维化及静脉内膜增生的作用[3-4]，但考虑到临床上两者多相伴随，如接受冠状动脉旁路移植术（CABG）或支架植入术（PTCA）的冠心病患者多伴有慢性充血性心力衰竭和心肌重构，这些患者术后仍将面临心肌肥厚、纤维化、心力衰竭和静脉桥管再狭窄的问题，故本研究尝试探索PMQ对这类患者是否有益。本实验通过制作大鼠颈部静脉移植模型并用血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导心肌重构模拟接受搭桥术的冠心病患者的体内情况，通过口服PMQ干预，研究其是否有治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠30只（体重250～300 g，同济医学院实验动物学部），正常喂养。所有大鼠均建立颈部自体静脉移植模型，并均于第15 天开始皮下注射AngⅡ [288 μg/（kg·d），分 5次颈项部皮下缓慢注射][5]，于 21 d 后取材。

1.2 模型建立

所有手术均由同一人操作完成，所用显微镜是Carl Zeiss单人双目手术显微镜（德国蔡司光学仪器公司），所用显微外科手术器械购自上海手术机械厂。

10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后，1%肝素1 mL/kg腹腔注射肝素化。颈部备皮，纵行切口，无损伤游离颈外静脉，用9-0 无损伤Polypropylene缝线（上海医用缝合针厂）行颈外静脉与颈总动脉的端端间断吻合。如静脉移植血管充盈、红润、随动脉一起搏动良好，则说明血管通畅，将血管复位，消毒后关闭切口。

1.3 分组及取材

动物被平均随机分为三组：模型组、溶剂组、治疗组。分别每晨给予生理盐水（5mL/kg）、溶剂[二甲亚砜（DMSO）和5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 溶剂按1∶9 配制，5mL/kg]和25mg/kg PMQ灌胃（DMSO为溶剂配制5%PMQ母液，每次给药前按PMQ母液和5%PVP溶液1∶9 比例制成0.5%的PMQ黄白色乳剂，按5mL/kg即25mg/kg灌胃）。于第22 天麻醉后于原颈部切口处剪开皮肤，游离移植静脉及两端足够长的颈动脉。迅速开胸，取出心脏称重。将移植静脉及左室中段于4%多聚甲醛中固定，其余心肌组织液氮冻存待测。石蜡包埋，连续切片（厚5μm），取3 张切片行HE染色。

1.4 心肌肥厚指标测定

剪除心房和大动脉，吸干，用分析天平称量心脏（HW）及左心室（LW）重量，除以体质量（BW），得心脏指数（HW/BW）及左心指数（LW/BW）。

1.5 心肌纤维化指标测定

羟脯氨酸含量用氯胺T法检测（南京建成公司）。胶原容积分数（CVF）Ⅰ/Ⅲ用免疫组化染色后用图像分析系统（Image-Pro Plus 5.0）测定。每张切片随机选6个视野（不含血管周围胶原），计算每个视野Ⅰ、Ⅲ型胶原阳性部分占视野面积百分比，取其均数即为CVF。

1.6 新生内膜增生测定

每张切片随机4个点，用图像分析系统（Image-Pro Plus 5.0）测量内膜（I）与中膜（M）的厚度、面积比。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0 对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析及Tukey HSD，以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组左心指数和心脏指数比较

LVW/BW和HW/BW是反应心肌肥厚程度的指标。结果显示溶剂组和模型组LVW/BW和HW/BW差异均无统计学意义。而治疗组的LVW/BW和HW/BW明显低于以另外两组，差异均有统计学意义（P<0.05 或P<0.01）。见表1。

2.2 各组羟脯氨酸含量和CVFⅠ/Ⅲ比较

羟脯氨酸的含量可反映心肌总体纤维化的程度，CVFⅠ/Ⅲ反应心室顺应性。治疗组的心肌羟脯氨酸含量和CVFⅠ/Ⅲ显著低于模型组，差异均有高度统计学意义（均P<0.01），从而抑制心肌纤维化，而溶剂组与模型组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。 见表2。

表1 各组左心指数和心脏指数比较结果（±s，mg/g）

表1 各组左心指数和心脏指数比较结果（±s，mg/g）

注：与治疗组比较，#P<0.05，##P<0.01

组别 HW/BW LVW/BW模型组（n=10）溶剂组（n=10）治疗组（n=10）2.87±0.23##2.93±0.39##2.55±0.38 2.29±0.24#2.38±0.17#1.98±0.20

表2 各组羟脯氨酸含量及CVFⅠ/Ⅲ（±s）

表2 各组羟脯氨酸含量及CVFⅠ/Ⅲ（±s）

注：与模型组比较，##P<0.01

组别 羟脯氨酸含量（μg/g） CVFⅠ/Ⅲ模型组（n=10）溶剂组（n=10）治疗组（n=10）503.5±31.4 498.3±25.8 422.1±31.8##4.7±0.8 4.6±0.6 3.4±0.6##

2.3 各组I/M厚度比及面积比

HE染色可见，模型组的新生内膜明显增生，而治疗组的I/M厚度比和面积比均明显小于模型组和溶剂组，差异均有高度统计学意义（均P<0.01）。见表3。

表3 各组I/M厚度比及面积比（±s）

表3 各组I/M厚度比及面积比（±s）

注：与治疗组比较，##P<0.01

组别 I/M厚度比 I/M面积比模型组（n=10）溶剂组（n=10）治疗组（n=10）1.51±0.35##1.57±0.17##0.89±0.18 1.83±0.33##1.79±0.28##1.15±0.14

3 讨论

冠心病患者往往同时患有多种疾病，需服用多种药物。接受CABG或PTCA的患者，其远期效果取决于血管新生内膜增生的程度。如大隐静脉是搭桥手术最常用的静脉桥管，由于移植静脉新生内膜的增生，其10年闭塞率超过50%。虽然随着手术技术的改进，其通畅率较前好转，但内膜的增生并不能通过手术技巧的改进而彻底改善。由于冠心病患者术前既已发生心肌肥厚、纤维化等重构改变，术后虽然心肌供血得以改善，但亦面临心肌重构发展、慢性充血性心力衰竭加重的问题，仍需服用减轻心肌重构的药物。同时移植桥管内膜的增生所致远期再狭窄必须予以预防和治疗。很多患者同时还患有高血压、糖尿病、高血脂和肥胖等相关疾病，如代谢综合征。而这些疾病相互关联，部分有着共同的机制。有学者试图寻找某些药物在使患者面临多个问题时能同时获益，槲皮素是其中之一。PMQ比槲皮素有更好的生物利用度、更容易经胃肠吸收、血药溶度更好，而且某些生物学特性更优。之前由于PMQ获得量少无法进行大剂量研究，目前工艺的改进突破了药源瓶颈，可以更好地研究其药理学特性。已有的研究表明PMQ的主要药理作用有：抑制细胞增值；促NO释放；抗氧化，包括直接的抗氧化活性和抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的活性。NADPH氧化酶是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要源头，并能调节其他途径ROS的产生。ROS在心肌重构、移植静脉再狭窄、动脉粥样硬化等的发生发展中均起重要作用，被认为是其重要的共同机制之一[6]，因此PMQ可能同时治疗心肌重构和移植静脉的再狭窄。

皮下注射AngⅡ可诱导大鼠心肌重构[7]。本实验通过对行颈部静脉移植模型的大鼠皮下注射AngⅡ诱导心肌重构模拟接受搭桥或支架植入手术冠心病患者的体内情况。结果表明PMQ能显著减少实验大鼠的心肌肥厚及纤维化的程度从而抑制心肌的重构；同时PMQ能显著抑制血管新生内膜的形成。此结果提示PMQ能同时治疗接受搭桥或支架植入手术的冠心病患者面临的两大主要问题。

随着经济的发展，人们的生活方式的改变，许多冠心病患者同时合并多种疾病，病情复杂，而且这些将会相互作用，影响CABG的手术效果。如糖尿病、肥胖、高血压、心力衰竭会加速再狭窄的发生，而冠脉血管的再狭窄又会加重心力衰竭。因此应当有一种方法，在分别治疗的同时进行综合治疗这些相互关联的疾病从而达到更好的治疗效果。本实验结果表明PMQ有作为治疗那些行CABG或PTCA患者药物的潜力。虽然PMQ在实验中表现出来的效果并不是很理想，但即使是作为行CABG或PTCA患者的辅助治疗性药物，也值得进一步研究。

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[2] Geleijnse JM，Hollman P.Flavonoids and cardiovascular health：which compounds，what mechanisms?[J].Am J Clin Nutr，2008，88（1）：12-13.

[3] Mao Z，Liang Y，Du X，et al.3，3'，4'，5，7-Pentamethylquercetin reduces angiotensinⅡ-induced cardiac hypertrophy and apoptosis in rats[J].Can J Physiol Pharmacol，2009，87（9）：720-728.

[4] 毛张凡，徐小惠，孙宗全，等.五甲基槲皮素抗静脉移植物狭窄[J].中华胸心血管外科杂志，2010，26（6）：405-408.

[5] 毛张凡，徐小惠，黄杰，等.大鼠颈部自体静脉移植模型两种吻合方法的比较[J].中国比较医学杂志，2011，21（12）：31-33，41，98.

[6] Quinn MT，Gauss KA.Structure and regulation of the neutrophil respiratory burst oxidase： comparison with nonphagocyte oxidases[J].J Leukoc Biol，2004，76（4）：760-781.

[7] Matsuno K，Yamada H，Iwata K，et al.Nox1 is involved in angiotensin Ⅱ-mediated hypertension：a study in Nox1-deficient mice[J].Circulation，2005，112（17）：2677-2685.