“渐处理”对肺缺血再灌注损伤的保护作用

麻日虎 李 莹 王玉旋 张 静

1.广东省深圳市龙岗区人民医院外科，广东深圳 518172；2.山西省肿瘤医院胸外科，山西太原 030013

缺血/再灌注损伤主要发生在再灌注的初期，与长时间缺血后突然再灌注引起细胞呼吸爆发、氧自由基的堆积、Ca2+超载等有关。多年来，针对如何进行再灌注干预一直是减轻缺血器官损伤研究的热点[1]。“渐处理”也称逐渐、温和或阶段性再灌注，是指缺血再灌注时从零开始逐渐增加血流到不加以控制。研究证实，缓慢地再灌注可以减轻缺血再灌注损伤[2-4]。“渐处理”作为一种改良的缺血后处理方式，不需要预知缺血事件发生的时间，又没有繁琐的再灌注/缺血循环操作，不附加额外的缺血，可能有更广阔的临床应用前景。本实验拟通过建立大鼠在体肺缺血再灌注模型，探讨“渐处理”对肺缺血再灌注损伤的作用及机制，现报道如下：

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

健康雄性SD大鼠40只，体重250～350 g，由南京医科大学实验动物中心提供。参附注射液由雅安三九药业有限公司生产，国药准字Z51020664。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）检测试剂盒均购置于南京建成生物工程公司；细胞凋亡检测试剂盒购置于武汉博士德生物工程公司。

1.2 动物模型制备

参照Eppinger等[5]大鼠肺缺血再灌注损伤模型加以改进，健康大鼠以戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，尾静脉注射肝素。气管切开后进行气管插管，小动物呼吸机辅助通气。胸骨右缘第四肋间开胸，于吸气末用无创血管夹阻断右肺门包括右主支气管和右肺动静脉 （以肺无舒缩为阻断标准）。并应用温热的37℃生理盐水棉纱敷盖创口。缺血的时间为45min，为缺血期。45min后放开结扎线，使肺脏充盈后，计时120 min，为再灌注期。再灌注期结束后左房放血处死大鼠。

1.3 动物分组及处理

40只大鼠随机分成四组，每组10只。手术对照组（S组）：仅解剖，不阻断右肺门持续灌注165min；缺血再灌注组（I/R组）：在吸气末用无创伤血管夹阻断右肺门，45min后开放再灌注120min；缺血后处理组（IPO组）：阻断右侧肺门45min后，短暂再灌注10 s，缺血10 s，反复5次，然后再全面恢复灌注120 min；缺血后渐处理组（IGR组）：阻断右侧肺门45min后，逐步恢复再灌注血流，50%1 min，80%2 min，然后再全面恢复灌注120 min。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 肺组织湿干重比（W/D）用滤纸吸去右肺上叶血，分析天平称重为湿重，置于70℃电热恒温干燥箱中烤至恒重，称重为干重，计算肺W/D比值。

1.4.2 病理检查取约1 cm×1 cm×1 cm新鲜右肺组织，沾去表面血迹，经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色后光学显微镜观察。

1.4.3 肺组织MDA、SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法测血浆SOD活性；硫代巴比妥酸法测MDA活性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 12.0统计软件包进行资料录入、整理及统计分析处理，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采采用单因素方差分析和t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组大鼠肺组织湿干比比较

I/R组、IPO组及IGR组大鼠肺组织W/D明显高于S组（P＜0.01）。IPO组及IGR组大鼠肺组织W/D值明显低于I/R组（P＜0.01）。IPO组及IGR组大鼠肺组织W/D比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 四组大鼠肺组织湿干比比较（±s）

表1 四组大鼠肺组织湿干比比较（±s）

注：与S组比较，**P＜0.01；与I/R组比较，##P＜0.01

组别只数 W/D S组I/R组IPO组IGR组10 10 10 10 4.96±0.13 6.40±0.25**5.48±0.20**##5.28±0.25**##

2.2 四组大鼠肺组织病理变化

光镜下S组肺泡腔内无水肿、出血及坏死，间隔无增宽，无炎症细胞浸润，结构清晰可见；I/R组肺泡腔内明显出血、水肿、血管扩张、炎性细胞浸润明显，并有局灶性肺气肿，肺泡间隔增宽，偶见局灶性坏死，组织细胞结构紊乱；与I/R组比较，IPO组及IGR组肺组织水肿、出血、炎性细胞浸润等明显减轻。

2.3 四组大鼠肺组织匀浆中SOD活力及MDA水平比较

与S组大鼠比较，I/R组、IPO组及IGR组大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显降低，MDA水平明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；与 I/R 组大鼠比较，IPO 组及 IGR组大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显升高，MDA水平明显降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；IPO组大鼠肺组织匀浆中SOD活力明显低于IGR组（P＜0.05），两组MDA水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 四组大鼠肺组织匀浆中SOD活力及MDA水平比较（±s）

表2 四组大鼠肺组织匀浆中SOD活力及MDA水平比较（±s）

注：与 S组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；与 I/R 组比较，##P ＜0.01；与 IPO组比较，△P＜0.05

组别只数 MDA（nmoL/mg） SOD（U/mg）S组I/R组IPO组IGR组10 10 10 10 42.13±3.40 69.63±7.03**53.28±4.46**##48.58±4.29*##120.40±13.03 63.80±5.19**81.50±8.21**##94.46±12.67**##△

3 讨论

人们已越来越认识到再灌注是一把“双刃剑”，一方面使缺血组织细胞重获血供，挽救了缺血组织损伤，另一方面它产生大量活性氧类和Ca2+超载等，会导致比单纯缺血更为严重的损伤，即所谓的缺血再灌注损伤[6]。近年来，对如何减轻并防止再灌注损伤进行了广泛的研究，包括缺血前的预处理和缺血后处理[7]。缺血后处理不需要预知缺血事件发生的时间，更具有操作性和临床价值，因此成为目前研究的热点，并已在不同动物的不同器官证明了缺血后处理对缺血/再灌注器官的保护作用。目前有多种后处理方法应用于基础和临床研究中[8]。

研究证实，“渐处理”作为一种改良的后处理方式，和后处理一样均促进再灌注后心功能的恢复，并降低再灌注后心肌损伤，且没有繁琐的再灌注/缺血循环操作，更易于临床应用[2-3]。本研究应用动物试验模型研究了“渐处理”对肺缺血再灌注损伤的影响及机制。肺毛细血管内皮细胞受损是肺缺血再灌注损伤的特征性改变，主要表现为肺血管通透性和血管阻力增加、肺顺应性降低，导致肺水肿。本实验从细胞结构观察，以及对肺组织含水量的检测发现，I/R组肺W/D较S组显著增加，表示肺组织微血管通透性增高，血管内水分漏出增加，且光镜下可见肺泡间隔变窄，炎性细胞浸润及出血，呈典型的肺损伤形态学改变。IPO组及IGR组组织、细胞结构仍清晰，损伤程度较肺I/R组明显减轻，肺W/D显著降低，IPO组及IGR组无明显差异。表明“渐处理”能够减轻大鼠缺血再灌注肺损伤，其保护作用可能通过改善肺毛细血管的通透性、减轻肺的氧化应激反应、减少中性粒细胞的聚集等机制得以实现。

研究证实，肺缺血再灌注损伤的发病机制与氧自由基及脂质过氧化反应有关[9]。MDA是脂质过氧化的最终产物，测定MDA可直接反映自由基水平，其含量高低是组织细胞损伤的重要标志。SOD是自由基的重要清除酶之一，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，因而SOD活性可反映机体对氧自由基清除能力的高低。本组实验中，观察了“渐处理”对脂质过氧化损伤的保护作用。结果发现IGR组，SOD活力明显高于I/R组及IPO组，而MDA水平明显低于I/R组；表明“渐处理”具有清除超氧化物阴离子自由基、减轻脂质过氧化损伤、保护细胞的作用，从而保护缺血/再灌注过程中的肺组织细胞，减轻了缺血及再灌注的损伤作用。

实验结果证明，经典缺血后处理及“渐处理”对缺血再灌注损伤肺组织均有保护作用。“渐处理”作为一种改良的后处理方式，由于没有繁琐的再灌注/缺血循环操作，以及对缺血器官“二次缺血”的打击，是一种更有效的、更适合临床应用的、减轻再灌注损伤的方法。

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