脂肪源性干细胞穴位注射对大鼠脑缺血再灌注后胰岛素样生长因子1及其受体表达的影响

李文媛，王莹，刘洋，佟晓杰

(1.牡丹江医学院，a解剖教研室，b病原生物学教研室，牡丹江157011;2.中国医科大学解剖教研室)

·基础研究·

脂肪源性干细胞穴位注射对大鼠脑缺血再灌注后胰岛素样生长因子1及其受体表达的影响

李文媛1a，王莹1a，刘洋1b，佟晓杰2

(1.牡丹江医学院，a解剖教研室，b病原生物学教研室，牡丹江157011;2.中国医科大学解剖教研室)

目的 探讨脂肪源性干细胞(ADSC)穴位注射对大鼠缺血/再灌注损伤后胰岛素样生长因子1 (IGF-1)及其受体(IGF-1R)表达的影响。方法 线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)2 h再灌注模型，大鼠随机分为假手术组、模型组、穴位注射ADSC组(治疗组)、穴位注射0.9%氯化钠注射溶液组(对照组)。治疗组取在大椎、双侧内关穴位注射PKH-26标记ADSC细胞悬液。缺血72 h后NSS法检测神经功能恢复，采用实时荧光定量PCR及免疫组织化学方法检测IGF-1、IGF-1R蛋白和mRNA的表达。结果 治疗组可见PKH26标记的ADSC在海马区有表达。与模型组和对照组比较，穴位注射ADSC组NSS评分显著降低(P＜0.05)，海马区IGF-1、IGF-1R蛋白和mRNA表达显著增加(P＜0.05)。结论 穴位移植脂肪源性干细胞对大鼠脑缺血再灌注有神经保护作用，其作用机制可能与促进海马区IGF-1和IGF-1R表达有关。

再灌注损伤;干细胞移植;胰岛素样生长因子Ⅰ;受体，IGF1型;大鼠，sprague-dawley

干细胞移植治疗脑缺血性疾病是近年来医学领域研究的一个热点，其中脂肪源性干细胞(ADSC)由于其来源广、易于体外扩增纯化，因此已成为进行干细胞移植的一个理想来源，我们前期研究发现［1］ADSC可以选择性地迁移并且作用于受损的脑组织，促进血管生成和神经再生，并促进神经功能的恢复。胰岛素样生长因子1(IGF-1)是一种多肽生长因子，在正常脑组织的生长发育中发挥重要作用，有研究表明IGF-1与其受体(IGF-1R)结合后［2］可激活受体酪氨酸激酶(RTK)，促进神经元细胞增殖、分化和迁移，可发挥神经保护效应。目前关于ADSC移植对脑缺血损伤中IGF-I和IGF-1R的影响尚不明确。而且以往干细胞治疗的移植途径较为局限，导致移植后干细胞向脑损伤区迁移能力及存活率较低，其神经再生效果并不理想［3］。为此我们将中医穴位注射与干细胞治疗结合，观察脂肪源性干细胞穴位移植对脑缺血损伤IGF-1及其受体IGF-1R表达的影响，为ADSC穴位注射治疗脑缺血损伤提供新的实验依据和理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、药品及试剂 雄性SD大鼠24只，清洁级，体质量280～320 g，购于中国医科大学实验动物中心(许可证号:SYXK［辽］2003-0013)。兔抗大鼠IGF-1抗体、兔抗大鼠IGF-1R抗体、SP试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中山生物技术有限公司。PKH-26试剂盒购于美国sigma公司。TRIzol试剂、SuperscriptII反转录酶、dNTPs购自Invitrogen公司，TaqDNA聚合酶、DL2000DNA标志物购自日本Takara公司，IGF-1、IGF-1R和β-actin引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2 ADSC培养及PKH26标记 脂肪组织由中国医科大学整形外科提供，来自于25～35岁要求去除腹部多余脂肪的健康成人，供体无传染病及内分泌疾病，男女比例为2∶8。告知其脂肪抽吸物将用于科学研究并知情同意。脂肪源性干细胞参照Zuk等［1］的方法进行分离培养，并换液传代，分离培养取第3～5代的ADSC，制成单细胞悬液后，参照Tohill［1］的方法进行PKH26标记ADSC。

1.3 动物分组与模型制备 大鼠按体质量分层，随机分为4组:假手术组(n=12)、模型组(n=12)、穴位注射ADSC组(治疗组，n=12)、穴位注射0.9%氯化钠注射溶液组(对照组，n=12)。参照Longa等［4］的线栓改良法复制大鼠大脑中动脉缺血模型。模型组:单纯造模，不予任何干预;治疗组和对照组于建模成功后3 h，取在大椎、双侧内关穴位［5］注射等体积的PKH-26标记ADSC细胞悬液(1×106细胞/穴)和0.9%氯化钠注射溶液。

1.4 神经功能评估 采用Chen等［6］报道的神经功能损害评分表(NSS)，从运动、感觉、反射、平衡4方面进行神经功能损害评估，22分为最严重的神经功能损害，即评分越高神经功能损害越严重。缺血后72 h各组大鼠分别进行NSS评分。

1.5 免疫组织化学染色 严格按照免疫组织化学试剂盒说明的步骤进行，其中一抗浓度IGF-1(1∶100)、IGF-1R(1∶100)。以PBS代替一抗作阴性对照。阳性率的定量分析:每个标本取4张切片，400倍光镜下每张切片在海马区随机选5个视野，用计算机图像分析系统(HPIAS-1000)对各组阳性细胞进行吸光度(absorbance，A)分析。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测 总RNA提取，采用Zacharek等［1］报道方法进行 PCR反转录、检测及荧光定量分析。引物设计及合成按照已报道的序列设计并合成VEGF以及内参照β肌动蛋白β-actin的特异性引物。各引物的序列为: IGF-1:上游5'-CAAAATGAGCGCACCTCCAATA-3'，下游5'-TTGAGGGAAATGCCCATCTCTG-3';IGF-1R:上游5'-AAACGCTGACCTCTGTTACCTCTC-3'，下游5'-GCGGATGAAGCCTGATGGAC-3';β-actin:上游5'-TGAAGGTCGGTGTCAACGGA-3'，下游5'-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3'。根据标准曲线将各样品测得的Ct值换算成拷贝数，分析各检测样本中目的基因拷贝数相对于阳性定量参考样品的基因拷贝数，分析方法利用2-△△CT方法。

1.7 统计学处理 所得数据以采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据以±s表示，多组均数间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 ADSC的培养 相差显微镜下观察，接种后24 h细胞贴壁，呈成纤维细胞样外观。培养48 h后可见细胞已经充分伸展呈长梭形，72 h后开始聚集形成细胞集落，6 d形成较密集的细胞群落。

2.2 PKH-26标记观察 冰冻切片免疫荧光追踪PKH-26标记的移植ADSC，可见穴位注射ADSC组在海马区有红色荧光信号表达。而假手术组、模型组及对照组没有发现红色荧光信号。

2.3 ADSC穴位移植对NSS评分的影响 脑缺血后72 h，假手术组NSS评分为0，模型组、对照组和治疗组NSS评分分别为(10.40±0.97)、(8.98± 0.33)和(6.47±0.51)，模型组、对照组和治疗组NSS评分高于假手术组(P＜0.05)。与模型组比较，对照组和治疗组NSS评分显著降低(P＜0.05)，其中治疗组NSS评分低于对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 ADSC穴位移植对IGF-1和IGF-1R表达的影响 IGF-1和IGF-1R阳性细胞胞浆着色，呈棕黄色或棕褐色。阴性细胞的细胞质不着色。模型组、对照组和治疗组NGF和BDNF蛋白表达较假手术组显著增加(P＜0.05)，其中治疗组IGF-1和IGF-1R蛋白表达较模型组和对照组显著增高(P＜0.05)，见表1。

表1 各组海马区IGF-1和IGF-1R吸光度值(±s)

表1 各组海马区IGF-1和IGF-1R吸光度值(±s)

注:与假手术组比较，aP＜0.05;与模型组比较，bP＜0.05

IGF-1 IGF-1R假手术组组别 鼠数(只) 6 18.81±2.20 4.48±0.72模型组 6 41.04±8.02a11.91±1.01a对照组 6 40.98±4.39a10.79±2.28a治疗组 6 80.62±8.48ab16.85±2.21ab

2.5 实时荧光定量PCR检测 各组IGF-1和IGF-1R mRNA表达趋势相同，模型组、对照组和治疗组IGF-1和IGF-1R mRNA相对表达较假手术组显著增加(P＜0.05)，其中治疗组IGF-1和IGF-1R mRNA相对表达较模型组和对照组显著增高(P＜0.05)，而模型组和对照组IGF-1和IGF-1R mRNA之间差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 各组海马区IGF-1和IGF-1R mRNA相对表达(2-ΔΔCt，±s)

表2 各组海马区IGF-1和IGF-1R mRNA相对表达(2-ΔΔCt，±s)

注:与假手术组比较，aP＜0.05;与模型组比较，bP＜0.05

IGF-1 IGF-1R假手术组组别 鼠数(只) 6 0.0115±0.0011 0.0022±0.0011模型组 6 0.0197±0.0022a0.0065±0.0021a对照组 6 0.0232±0.0062a0.0066±0.0007a治疗组 6 0.0337±0.0004ab0.0104±0.0013ab

3 讨论

近年来，随着干细胞研究的不断深入，干细胞移植治疗成为脑缺血损伤的热点，其中ADSC成为较为理想的选择，与骨髓间充质干细胞相比，ADSC具有其独特的优势［1］:(1)人类具有丰富的皮下脂肪，来源广泛;(2)能够通过安全的常规吸脂术获得，取材方便;(3)脂肪组织中的间充质干细胞的比例高于骨髓;(4)ADSC增殖速度快于骨髓间充质干细胞。但传统的干细胞给药方式，如外周静脉注射，腹腔注射，肌内注射，对移植后干细胞向缺血区迁移以及存活影响较大，不能较好的发挥干细胞促进神经再生的作用。近年来有研究发现［7］通过穴位注射骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死大鼠，能显著提高缺血心肌细胞的修复重建能力，疗效优于传统移植途径。为此，本实验将穴位注射穴位疗法和干细胞作用结合在一起，选取调督开窍、化癖通络的督脉大椎穴、心包经的内关穴［5］进行干细胞穴位注射治疗脑缺血大鼠模型。本研究结果表明穴位注射ADSC组海马区有大量存活的PKH-26标记的ADSC，证实了穴位注射ADSC能够沿着经线通过血脑屏障进入宿主脑内，迁移至缺血性损伤区域发挥作用。进一步研究发现穴位注射ADSC组神经功能恢复明显优于模型组和对照组，说明穴位注射干细胞能够较好的发挥神经功能恢复作用。

IGF-1是一种多肽生长因子，在正常脑组织的生长发育中发挥重要作用，有研究表明［8］IGF-1在体内外不同的损伤模型中有神经营养和神经保护效应，有研究表明脑损伤后IGF-1与受体IGF-1R的结合后可发挥神经恢复效应，调整脑屏障通透性，减少兴奋性中毒损伤，抑制细胞凋亡，并增加血管发生和神经发生。本实验中，穴位注射ADSC组IGF-1和IGF-1R蛋白及mRNA表达较模型组和对照组显著增高，NSS评分显著降低，提示穴位注射ADSC能够通过分泌和上调IGF-1和IGF-1R的表达，促进神经功能恢复，这与以往研究结果相一致［2］。

综上所述，穴位移植脂肪源性干细胞对大鼠脑缺血再灌注有神经保护作用，其作用机制可能与促进IGF-1和IGF-1R表达有关。

［1］ 王莹，李文媛，李明秋，等.黄芪皂苷Ⅳ联合脂肪源性干细胞对老龄大鼠脑缺血再灌注中神经营养因子表达的影响［J］.中国老年学杂志，2011，31(20):3963-3966.

［2］ Zhang J，Li Y，Chen J，et al.Expression of insulin-like growth factor 1 and receptor in ischemic rats treated with human marrow stromal cells［J］，Brain Res，2004，1030 (1):19-27.

［3］ Müller-Ehmsen J，Krausgrill B，Burst V，et al.Effective engraftment but poor mid-term persistence of mononuclear and mesenchymal bone marrow cells in acute and chronic rat myocardial infarction［J］.Mol Cell Cardiol，2006，41 (5):876-84.

［4］ 王莹，李文媛，郑海星，等.黄芪皂苷Ⅳ对大鼠脑缺血/再灌注损伤海马神经元凋亡及相关基因表达的影响［J］.中国临床保健杂志，2011，14(4):401-403.

［5］ 孔立红，毛娟娟，孙国杰.穴位埋药对脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积的影响［J］.上海针灸杂志，2007，26 (7):40-42.

［6］ Chen C，Hu Q，Yan J，et al.Early inhibition of HIF-1alphawith small interfering RNA reduces ischemic-reperfused brain injury in rats［J］.Neurobiol Dis，2009，33(3):509-517.

［7］ 张哲，杨关林，陈岩，等.穴位移植同种异体骨髓间充质干细胞对梗死区心肌再生的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(25):4837-4841.

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Effect of acupoint injection with adipose－derived stem cell on the expression of insulin-like growth factor 1 and receptor after cerebral ischemia/reperfusion in rats

LI Wen-yuan*，WANG Ying，LIU Yang，TONG Xiao-jie (*Department of Anatomy，Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China) Corresponding author:WANG Ying，E-mail:yingwang77022@163.com

Objective To investigate the effect of acupoint injection with adipose-derived stem cell on insulin-like growth factor 1(IGF-1)and receptor(IGF-1R)after cerebral ischemia-reperfusion in rats.Methods The rat model of middle cerebral artery occlusion was established in model.A total of 48 healthy SD rats were randomly divided into sham operation group，model group，ADSC acupoint injection group(treatment group)and saline acupoint injection(control group).ADSC suspensions were marked with PKH-26 were infused into acupoints of"Dazhui"and" Neiguan"in the treatment group.72 h after reperfusion，neuological function score were observed by NSS.The expressions of IGF-1 and IGF-1R were observed by using immunohistochemical and quantitative real-time RT-PCR.Results

PKH-26 labeled ADSC were observed in hippocampus region of the treatment group.Compared with model and control group，the NSS and the expression of IGF-1，IGF-1R of the treatment group were significantly increased(P＜0.05).Conclusion ADSC acupoint injection could improve the neurological function in rats after cerebral ischemiareperfusion，which may be related to up-regulating IGF-1 and IGF-1R in hippocampus region.

Reperfusion injury;Stem cell transplantation;Insulin-like growth factorⅠ;Receptor，IGF type 1;Rats，Sprague-dawley

R743.31

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2012.04.023

2012-02-07)

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(1152G050);黑龙江省卫生厅科研项目(2010243)

李文媛，讲师，E-mail:yuanyuan19800413@163.com

王莹，讲师，E-mail:yingwang770224@163.com